ДСТУ 8104:2015. Яйця харчові, продукти яєчні. Методи визначання мікробіологічних показників

Додаток В

(обов’язковий)

УСТАТКОВАННЯ, ЗАСОБИ ТА МАТЕРІАЛИ

В.1 Перелік устатковання для проведення мікробіологічних досліджень:

• автоклав вертикальний, що забезпечує температуру від 105 ^оС до 135 105 ^оС і тиск до 2 атм. згідно з чинними нормативними документами;
• іономір універсальний ЭВ-74 або потенціометр універсальний рН-340 згідно з чинними нормативними документами з похибкою не більше ніж ±0,05;
• ваги лабораторні І або ІІ класу точності згідно з ГОСТ 24104 з найбільшою межею зважування 200 г і допустимою похибкою ±2 мг для зважування реактивів;
• ваги лабораторні ІІІ класу точності згідно з ГОСТ 24104 з найбільшою межею зважування 1000 г і допустимою похибкою ±10 мг;
• термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру від 28 ^оС до 55 ^оС з точністю ±0,2 ^оС, згідно з чинними нормативними документами;
• холодильник електричний побутовий згідно з ГОСТ 16317-76;
• мікроскоп марки «Биолам Д-11» згідно з ГОСТ 8074 або аналогічний;
• мікроскоп світловий біологічний зі збільшенням у (900-1000)^х разів згідно з чинними нормативними документами;
• мікроскоп люмінесцентний зі збільшенням (63-1500)^х згідно з чинними нормативними документами;
• прилад для підрахування колоній бактерій зі збільшувальним склом х3 згідно з чинними нормативними документами;
• стерилізатор паровий медичний з режимами стерилізації від температури 100 ^оС (текучою парою) до 126 ^оС (під тиском) згідно з ГОСТ 19569 або аналогічний;
• дистилятор згідно з чинними нормативними документами, що забезпечує якість дистильованої води згідно з ГОСТ 6709 чи ДСТУ ISO 3696, або прилад для отримання води аналітичної якості;
• шафа сушильна стерилізаційна, яка забезпечує температуру від 100 ^оС до 200 ^оС згідно з чинними нормативними документами;
• магнітні мішалки з підігрівом до 30 ^оС для приготування середовищ згідно з чинними нормативними документами;
• прилад для струшування (шейкер), з амплітудою коливання від 3 мм до 4 мм і частотою від 4 Гц до 6 Гц за температури від 16 ^оС до 25 ^оС, або з коловим типом струшування, що має частоту обертів (200-1200) об/хв. та діаметр орбіти струшування у межах 3 мм, згідно з чинними нормативними документами;
• прилад для вимірювання оптичної щільності розчину (оптичний стандарт каламутності) на 10 од. з діапазоном вимірювання МакФарланда від 0 McF до 10 McF і довжиною хвилі (535 ± 20) нм згідно з чинними нормативними документами;

В.2 Перелік матеріалів та засобів для проведення мікробіологічних досліджень:

• баня водяна з терморегулятором, яка дозволяє підтримувати температуру від 20 ^оС до 100 ^оС з відхилом ±1 ^оС від заданої температури;
• дозатори для розливу поживних середовищ згідно з чинними нормативними документами;
• термометри рідинні скляні з діапазоном температури від мінус 50 ^оС до 50 ^оС згідно з ГОСТ 28498 з межею допустимої похибки ±0,5 ^оС і ціною поділки шкали 0,5 ^оС;
• лупа зі збільшенням у (5-10) разів згідно з ГОСТ 25706;
• спиртівки лабораторні скляні згідно з ГОСТ 25336;
• годинник механічний з сигнальним пристроєм згідно з ГОСТ 3145;
• скельця предметні згідно з ГОСТ 9284;
• скельця покривні згідно з ГОСТ 6672;
• петлі бактеріологічні № 0, № 1, № 2 згідно з чинними нормативними документами;
• пінцети медичні згідно з ГОСТ 21241;
• скальпель медичний згідно з ГОСТ 21240;
• ножиці медичні згідно з ГОСТ 21239;
• штативи для пробірок (металеві) згідно з чинними нормативними документами;
• чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
• ступки фарфорові з товкачиком згідно з ГОСТ 29225;
• палички скляні згідно з ГОСТ 25336;
• піпетки згідно з ГОСТ 29169;
• піпетки згідно з ГОСТ 29227;
• піпетки згідно з ГОСТ 29228;
• пробірки скляні бактеріологічні (біологічні) П2-10-90 ХС; П3-5ХС, тощо згідно з ГОСТ 25336;
• стакани місткістю 100 см³, 250 см³, 500 см³, 1000 см³ згідно з ГОСТ 25336;
• колби місткістю 100 см³, 250 см³, 500 см³, 1000 см³ згідно з ГОСТ 25336;
• колби конічні місткістю 40 см³, 200 см³, 400 см³, 1000 см³ та 1600 см³ згідно з ГОСТ 19908;
• колби мірні згідно з ГОСТ 1770;
• циліндри мірні згідно з ГОСТ 1770;
• лійки В-36-80ХС; ВФ-1-75ХС згідно з ГОСТ 25336 або ГОСТ 19908;
• марля медична згідно з ГОСТ 9412;
• марля побутова згідно з ГОСТ 11109;
• вата медична гігроскопічна згідно з ГОСТ 5556;
• папір фільтрувальний лабораторний згідно з ГОСТ 12026;
• поплавки (трубки Дархема) згідно з чинними нормативними документами;
• олівці по склу (склографи) згідно з чинними нормативними документами;
• папір індикаторний універсальний згідно з чинними нормативними документами;
• папір обгортковий згідно з ГОСТ 8273;
• пергамент згідно з ГОСТ 1341;
• підпергамент згідно з ГОСТ 1760;
• спирт для пальника (спиртівки) згідно з ГОСТ 18300 чи аналогічний;
• шпатель згідно з чинними нормативними документами;
• засоби мийні згідно з чинними нормативними документами;
• засоби для миття посуду (щітки, йоржі тощо) згідно з чинними нормативними документами;
• шпагат згідно з чинними нормативними документами.

В.3 Замість зазначених у цьому стандарті можуть використовуватися аналогічні засоби вимірювальної техніки, випробувальне та допоміжне обладнання, які за своїми метрологічними та технічними характеристиками задовольняють вимоги цього стандарту.

Додаток Г

(рекомендований)

Альтернативні та швидкі методи

Г.1 Для альтернативних і швидких методів, призначених для мікробіологічного контролювання харчових яєць та яєчних продуктів, використовують тест-системи вітчизняного чи закордонного виробництва, які стандартизовані та зареєстровані в Україні, згідно з нормативним документом від виробника.

Г.2 Матеріали та реактиви для швидких та альтернативних методів аналізу готують за прописом виробника.

Г.3 Використання хромогенних та флуорогенних поживних середовищ

Сутність дії хромогенних та флуорогенних поживних середовищ основана на виявленні високоспецифічних ферментів у мікроорганізмів, які визначаються.

До складу середовища входить хромогенний субстрат – речовина, під час розщеплення якої ферментами, специфічними для певного виду мікроорганізмів, утворюються продукти, які мають забарвлення і/або флуоресценцію, внаслідок чого колонії мікроорганізмів забарвлюються у певний колір або набувають здатності до флуоресценції під час ультрафіолетового опромінення. До складу середовищ також входять поживні речовини, що забезпечують швидкий ріст ентеробактерій, і дезоксихолат натрію, який інгібує супутню грампозитивну мікрофлору.

Г.3.1 Хромогенні та флуорогенні поживні середовища для визначання бактерій роду Salmonella

Хромогенний субстрат або суміш субстратів входять до складу поживних середовищ для визначання бактерій роду Salmonella, у тому числі і до селективних для первинного посіву.

Для диференціювання Salmonella від коліформних бактерій до складу середовища введено пропіленгліколь і хромогенну суміш, яка виявляє наявність ферменту ?–галактозидази – характерного ферменту коліформних бактерій.

Проведення дослідження. Після етапу селективного збагачення матеріал висівають на поверхню середовищ бактеріологічною петлею. Підготовлені чашки Петрі із середовищами опалесціюють і мають злегка рожевий колір. Перед посівом чашки треба підсушити. Інкубують в аеробних умовах від 24 год до 48 год за температури від 35 ^оС до 37 ^оС.

Оцінювання результатів. Salmonella утворюють на поверхні поживного середовища колонії червоного кольору, коліформи – синього або синьо-фіолетового, інші ентеробактерії – безбарвні або жовтуваті.

Г.3.2 Хромогенні та флуорогенні поживні середовища для визначання коліформних бактерій і бактерій роду E.coli

Використовують селективні хромогенні та флуорогенні індикаторні поживні середовища, принцип дії яких основано на виявленні специфічних ферментів – ?-галактозидази коліформних бактерій; ?-глюкуронідази та триптофанази E.coli. Специфічна активність ферментів проявляється внаслідок розщеплення хромогенних і флуорогенних субстратів, які входять до складу поживних середовищ. При цьому утворюються продукти, що флуоресцують або мають забарвлення, які змінюють колір (викликають флуоресценцію) рідких середовищ або характерно забарвлюють колонії на агаризованих середовищах.

До складу індикаторних середовищ входять якісні пептони та фосфатний буфер, які забезпечують оптимальні умови росту коліформних бактерій; триптофан, який дає можливість проведення індольного тесту для остаточного підтвердження E.coli; піруват натрію, який відновлює пошкоджені клітини коліформних бактерій і підвищує чутливість методу, а також селективні агенти (лаурилсульфат натрію, тергітол 7, солі жовчних кислот та пропіонова кислота), що інгібують ріст супутньої мікрофлори.

Проведення дослідження. Матеріал висівають бактеріологічною петлею на поверхню агаризованих середовищ або у пробірки з рідкими середовищами. Інкубують у термостаті протягом 24 год за температури від 35 ^оС до 37 ^оС.

Оцінювання результатів. Залежно від використовуваних середовищ можуть бути такі результати:

• фермент ?-галактозидаза коліформних бактерій розщеплює хромогенний субстрат зі зміненням кольору середовища або з утворенням хромогенного продукту, який забарвлює колонії у певний колір (змінення кольорів вказано в інструкції виробника, яка додається до тест-системи).
• фермент ?-глюкуронідаза E.coli розщеплює флуорогенний субстрат з утворенням продукту, який флуоресцує (при дії УФ-світла);
• фермент триптофаназа проявляється під час розщеплення триптофану, який входить до складу середовищ, з підтвердженням утворення індолу реактивом Ковача.

Г.3.3 Хромогенні поживні середовища для визначання бактерій Staphylocоccus aureus

Метод основано на використанні готових поживних сухих підкладок у вигляді підготовленої системи, яка містить набір поживних речовин, герметично закритої непроникною мембраною. Для виявлення бактерій Staphylocоccus aureus – це пластини хромогенного модифікованого середовища Беард-Паркера, яке є селективним і диференційованим для бактерій S. aureus.

Сутність методу. У середовище під час проведення дослідження додають спеціально розроблену суспензію яєчного жовтка, яка сприяє формуванню непрозорої зони навколо колоній S. aureus (коагулазопозитивна реакція).

Проведення та облік результатів досліджень – згідно з інструкцією виробника, яка додається до цієї тест-системи, з таким доповненням.

Після посіву тест-системи інкубують у термостаті за температури (35±2) ^оС протягом 24 год. Якщо після інкубування виявлено колонії з непрозорою зоною навколо них (коагулазополозитивна реакція), їх відносять до S. aureus. Інші види стафілококів утворюють на цьому середовищі колонії жовтого кольору, які не мають непрозорої зони.

Г.4 Використання ксилозо-лізинового дезоксихолатного агару (XLD Agar, КЛД-агар)

Цей селективно-диференційний агар рекомендовано для виділення та ідентифікації патогенних кишкових бактерій у тесті на наявність-відсутність E.coli та сальмонел. Середовище підходить для скринінгу проб зі змішаною мікрофлорою і його пропонується використовувати з діагностичною метою для ідентифікації ентеробактерій.

Має вигляд гомогенного сипкого рожевого порошку, з якого готують середовище зі щільністю, відповідною 1,5 % агаровому гелю, і рН (7,4±0,2) за температури 25 ^оС. Середовище має червоне забарвлення, прозоре або має легку опалесцентність.

До складу середовища входить:

• дезоксихолат, який подавляє ріст грампозитивних бактерій;
• ксилоза, яку ферментують майже всі ентеробактерії, окрім шигел, що дозволяє відрізняти їх від сальмонел;
• лізин, який декарбоксилюють сальмонели;
• індикатор феноловий червоний.

Проведення дослідження. Готують середовище, для цього розмішують 56,68 г порошку у 1000 мл дистильованої води, обережно підігрівають з частим помішуванням до закипання середовища. Середовище не можна автоклавувати, не допускати перегріву. Краще готувати на водяній бані з температурою 50 °С. Не рекомендовано готувати великі об’єми середовища, щоб не допускати тривалого нагрівання середовища.

Середовища розливають у стерильні чашки Петрі, на які після застигання середовища висівають досліджуваний матеріал. Інкубують у термостаті за температури (35-37) °С протягом (18-24) год.

Оцінювання результатів. Бактерії роду Salmonella утворюють колонії з чорним центром, Shigella flexneri – безбарвні колонії, Escherichia coli – колонії жовтого кольору.

Г.5 Використання тест-системи НоваСтрік

Тест-системи НоваСтрік призначені для визначення показників біологічної безпеки: загальної кількості мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів (МАФАМ), загальних коліформних бактерій, дріжджових та пліснявих грибів, стафілококів, ентерококів, сальмонел та шигел. Принцип методу та загальна процедура проведення дослідження. Тест-система НоваСтрік являє собою пластикову лопатку, покриту по обидва боки відповідними агаризованими поживними середовищами в залежності від показників, для визначення яких призначена тест-система. Лопатка вставлена одним кінцем у кришку, що загвинчується, і поміщена в прозору пластикову пробірку. Пластикове кільце з подовженими зубцями прикріплено до іншого кінця лопатки таким чином, щоб над кожною її стороною розташовувалося по три зубці. Кінці зубців занурюються безпосередньо у нерозведену рідку пробу, що досліджується, або у розведену 1:1 чи 1:10 пептонно-сольовим розчином у разі дослідження твердих продуктів. У процесі повернення лопатки у вихідну пробірку кільце з зубцями застряє в отворі пробірки і поверхні агарів, проходячи між кінцями застряглих зубців, протирають їх, роблячи в такий спосіб розсів матеріалу по своїй поверхні поживного середовища. Внаслідок цього з кожної сторони агару виходить серія смужок-штрихів зі зменшуваною бактеріальною концентрацією, що дозволяє отримати ізольовані колонії, навіть у випадках високих концентрацій мікроорганізмів у пробі. Кількісний облік проводять, порівнюючи кількість колоній, що виросли з графіками щільності проросту колоній, прикладеними до кожного пакування тест-системи, та згідно з методичними рекомендаціями [8].

Г.5.1 Визначання мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів (МАФАМ)

Кількість колонієутворюючих одиниць (КУО) мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів (МАФАМ) в 1 г сухих чи 1 см³ рідких яєчних продуктів визначають штриховим методом посіву на тест-систему НоваСтрік (шляхом занурення зубців, що засівають, у пробу без попереднього її розведення – для рідких яєчних продуктів, у відповідне розведення проби – для сухих.). Результат визначають після інкубування за температури (35-37) ^оС протягом (18-24) год. за допомогою графіків щільності проросту колоній.

Г.5.2 Визначання БГКП (коліформи)

Необхідну кількість досліджуваного продукту поміщають у середовище накопичення (середовище Кеслера) і після інкубації протягом (18-24) год. роблять посів на НоваСтрік методом занурення агарової пластинки в пробу (метод дипслайда). Повна відсутність характерних колоній на обох агарових поверхнях (згідно з графіком щільності проросту колоній) свідчить про відсутність БГКП в 0,1 г (0,1 см³) або в 1,0 г (1,0 см³) досліджуваного зразка.

Г.5.3 Визначання Staphylococcus aureus

Методика посіву та облік результатів аналогічні Г.5.2. Як середовище накопичення використовується сольовий бульйон.

Г.5.4 Визначання сальмонел

Необхідну кількість 25 г або 25 см³ досліджуваного продукту поміщають у середовище накопичення (225 см³ магнієвого середовища), інкубують протягом (18-24) год. Після цього засівають на НоваСтрік методом занурення агарової пластинки у пробу на середовище збагачення (метод дипслайда). Попередній облік результатів через 18 год., остаточний – через 24 год. На стороні з (XLD) Agar сальмонели утворюють червоні колонії або ростуть у вигляді червоних/пурпурових колоній з чорним центром, на іншій стороні пластини з Salmonella ID Agar на хромогенній основі сальмонели ростуть у вигляді зелених колоній.

Г.6 Використання біохімічних пластин для диференціації ентеробактерій (ПБДЕ)

Призначення пластин – визначання ферментативної активності мікроорганізмів родини Enterobacteriaceae, які виділені у процесі бактеріологічного аналізу, та диференціація їх до виду.

Принцип методу та загальна процедура проведення дослідження. ПБДЕ – пластина з 20 конусоподібними лунками, які містять сухі поживні субстрати з індикаторами. Дозволяє визначати такі біохімічні властивості культур ентеробактерій: утилізацію цитрату натрію, як у присутності цукру (модифікація цитратного середовища Кристенсена), так і без нього (модифікація цитратного середовища Симмонcа), малонату натрію, глюкози, лактози, маніту, сахарози, інозиту, сорбіту, арабінози, мальтози, утворення індолу, сірководню, ацетилметилкарбінолу (реакція Фогес-Проскауера), наявність уреази, ?-галактозидази, декарбоксилаз орнітину та лізину, дегідролази аргініну, дезамінази фенілаланіну.

До складу набору входять також додаткові реагенти для обліку результатів аналізу: заліза (III) хлорид гексагідрат, пара-диметиламінобензальдегід, ?-нафтол, калію гідроокис, фосфатно-сольовий буферний розчин сухий (гідрофосфат, калію дигідрофосфат, натрію хлорид) масло вазелінове.

Досліджувану культуру вносять у лунки пластини і інкубують за температури (37±0,5) ?С протягом часу до 24 год. Облік результатів проводять візуально відповідно до кольорового покажчика, який додається до набору. Облік результатів тесту на виявляння ?-галактозидази проводять двічі: через (3–5) год. та через (18–24) год. (у деяких штамів забарвлення у лунці через (18–24) год зникає.

Після закінчення інкубації відкривають кришку пластини і в лунку для виявляння фенілаланіндезамінази додають 1 краплю 10 % розчину заліза (III) хлориду, в лунку для визначання ацетилметилкарбінолу – 1 краплю 6 % розчину ?-нафтолу і 1 краплю 40 % розчину гідрокису калію, в лунку для виявляння індолу – (1-3) краплі реактиву Ерліха. Ацетилметилкарбінол виявляють через (15-20) хв. після додавання реактиву.

Культури мікроорганізмів ідентифікують з використанням таблиці біохімічних властивостей ентеробактерій, діагностичного «ключа», кодової карточки, каталогу кодів – посібника для інтерпретації результатів ідентифікації з використанням математичного методу класифікації (додаються до набору).

Г.7 Використання мікротест-систем (МТС) для біохімічної ідентифікації бактерій

МТС – системи одноразового використання для ідентифікації мікроорганізмів за біохімічними властивостями. МТС призначені для визначання біохімічної активності мікроорганізмів, виділених у процесі бактеріологічного досліджування та ідентифікації представників певного роду до виду.

Ідентифікацію культур, які виділені безпосередньо з нативного матеріалу, проводять з похилого поживного агару. Використовують культури, вирощені протягом (18-24) год за температури (37±1) ⁰С. Якщо виділена культура мікроорганізму знаходилась деякий час на зберіганні за температури (22±2) ⁰С або у холодильнику за температури (6±2) ⁰С, здійснюють попередній посів її на поживний бульйон. Посіви інкубують протягом (3±1) год за температури (37±1) ⁰С, потім культуру висівають на похилий поживний агар. Через (21±3) год інкубації за температури (37±1) ⁰С роблять змив культури з поверхні похилого агару 5 мл стерильної дистильованої води.

Проведення дослідження. Контейнер дістають з коробки і реєструють на паперовій смужці на стінці контейнера номер штаму, який засівають. Знімають поліетиленову стрічку (не повністю) і поміщають контейнер у чашку Петрі ( в 1 чашку поміщуються 3 контейнери). Стерильною градуйованою піпеткою місткістю 1 мл 2-го класу точності вносять по 0,1 мл мікробної суспензії в усі чарунки контейнера. Контейнер щільно закривають поліетиленовою стрічкою з липким шаром. Витримують чашку з контейнером у термостаті за температури (37+1) ⁰С протягом (20±2) год.

Облік результатів проводять візуально відповідно до кольорового покажчика для певного виду мікроорганізмів, який додається до кожної тест-системи.

Г.7.1 Ідентифікація сальмонел

МТС для ідентифікації сальмонел дозволяє визначати такі біохімічні властивості: ферментацію глюкози, інозиту, арабінози, рамнози, ксилози, утилізацію цитрату натрію, наявність сірководню. Специфічна дія препарату полягає у можливості диференціювати сальмонели на підставі визначання ферментативних систем за їхньою дією на вуглеводи та інші субстрати. Дослідження культур проводять за загальною схемою. Для створення анаеробних умов чарунку для виявляння сірководню заповнюють доверху стерильним розплавленим парафіном або стерильним вазеліновим маслом. Облік результатів проводять візуально відповідно до кольорового покажчика для сальмонел, який додається до тест-системи.

Г.7.2 Ідентифікація стафілококів

МТС для ідентифікації стафілококів дозволяє визначати такі біохімічні властивості: ферментацію глюкози та маніту, окислення глюкози та маніту утилізацію лактози, ксилози, сахарози, мальтози, манози, галактози, наявність уреази, аргініндегідролази. Специфічна дія препарату полягає у можливості диференціювати стафілококи на підставі визначання ферментативних властивостей. Дослідження культур проводять за загальною схемою. Для створення анаеробних умов заповнюють чарунки для виявляння ферментації глюкози, маніту, наявність уреази та аргініндегідролази стерильним розплавленим парафіном доверху або вазеліновим маслом на 2/3 об’єму чарунки. Облік результатів проводять візуально відповідно до кольорового покажчика для стафілококів, який додається до тест-системи

Г.8 Метод латексної аглютинації для серотипування Salmonella

Використовують тест-системи для Salmonella (S.typhimurium, S.enteritidis тощо), зареєстровані в Україні.

Сутність методу. Тест-система призначена для швидкого серологічного аналізу Salmonella у культуральних бульйонах та з виділених чистих культур методом латексної аглютинації з метою визначення їх приналежності до основних серологічних груп.

В основі дії тест-системи лежить взаємодія специфічних антитіл Salmonella груп А, В, С, Д, Е, нанесених на латексні часточки, та антигеном сальмонел, які знаходяться у бульйоні чи суспензії.

До комплекту тест-системи входять імунореагенти, які представляють собою суміші латексних суспензій червоного, блакитного та зеленого кольору. Кожна латексна суспензія сенсибілізована антитілами до певної групи Salmonella. У ході аналізу кольорові латексні часточки утворюють агрегати зі специфічними антигенами Salmonella, що призводить до зміни кольору. Цей метод оснований на візуальному визначанні наявності конгломератів аглютинації, колір яких відповідає конкретній серологічній групі Salmonella.

Проведення та облік результатів досліджень – згідно з інструкцією виробника, яка додається до тест-системи.

Г.9 Метод гібридизаційного ДНК-РНК аналізу

Використовують прилад «Люмипроб-24» або аналогічний прилад-люмінометр, зареєстрований в Україні. Метод основано на твердофазному гетерогенному гібридизаційному ДНК-РНК аналізі з хемілюмінесцентним детектуванням.

Сутність методу. Метод гетерогенного твердофазного гібридизаційного аналізу нуклеїнових кислот основано на принципі гібридизації ділянки бактеріального геному із закріпленими на твердофазному носії (стінки пробірки) комплементарним до визначеної послідовності ДНК олігонуклеотидним зондом, міченим флуоресцентним барвником, і подальшій детекції гібридів за ступенем їхньої хемілюмінесценції у приладі-люмінометрі.

Метод виконується у форматі тест-систем (наборів).

Метод передбачає висівання певної кількості досліджуваного зразка у спеціальні неселективні і селективні середовища, інкубування посівів для накопичення мікроорганізмів, оброблення культуральної рідини лізуючим буфером для денатурації бактеріальної рибосомальної РНК, гібридизацію фрагментів денатурованої РНК з комплементарним їй міченим зондом, який входить до наборів тест-систем, хемілюмінесцентним детектуванням продуктів реакції.

Проведення та облік результатів досліджень – згідно з інструкцією виробника, яка додається до експрес-тестів.

Г.10 Імунохроматографічні експрес-тести

Використовують експрес-тести, зареєстровані в Україні.

Сутність методу. Імунохроматографічні експрес-тести призначені для виявлення (індикації) бактерій роду Salmonella, Listeria, E.coli 0157. Вони представляють собою діагностичну тест-панель з лункою для внесення зразка і вікном з тестовою та контрольною зонами.

Принцип дії експрес-тестів оснований на методі візуальної імунохроматографії – різновиду імуноферментного аналізу. Антигени досліджуваних бактерій, які є у дослідному зразку, взаємодіють з міченими золотом антитілами з утворенням комплексу антиген-антитіло. Під час проходження по підкладці тесту комплекс антиген-антитіло зв’язується з імобілізованими антитілами з утворенням червоних ліній у тестовій і контрольних зонах.

Досліджують попередньо збагачені зразки.

Проведення та облік результатів досліджень – згідно з інструкцією виробника, яка додається до експрес-тестів.

Г.11 Використання комп’ютерних аналізаторів колоній мікроорганізмів

Сутність методу. Метод оснований на застосуванні оптико-електронного приладу, який складається з блока реєстрації цифрових зображень чашок Петрі у режимі прохідного і відбитого освітлення та комп’ютера з програмним забезпеченням.

Умовно поділяють на:

• напівавтоматичні системи – Labsystems (Фінляндія), MiniAPI або його аналог ATB-Expression, bioMerieux (Франція) тощо;
• автоматичні системи – VITEK та VITEK2 (bioMerieux, Франція), BD Phoenix (Becton Dickinson, США), WalkAway (Dade Behrig, США) тощо.

Початкові етапи роботи на будь-якому автоматичному бактеріологічному аналізаторі схожі: у першу чергу треба одержати чисту молоду (18-24)- годинну культуру бактерій, після чого провести мікроскопію і фарбування за Грамом, поставити деякі орієнтовні тести. Ця первинна інформація про культуру бактерій визначає вибір тест-систем (панелей) для подальшої роботи з культурою уже на приладі. Використання готових тест-систем (панелей, стрипів тощо), спеціально розроблених фірмою-виробником для роботи на кожному конкретному приладі, суттєво спрощує і прискорює схему проведення ідентифікації мікроорганізмів і визначання антибіотикограми, а також дозволяє одержати високоспецифічний стандартизований результат. Тест-системи для одного приладу не можуть використовуватися для читання результату на іншому.

Для роботи на панелях (стрипах) треба приготувати розчин з вирощеної культури бактерій з високою точністю (у певному об’ємі рідини повинно бути строго визначена кількість мікроорганізмів, щоб не спровокувати одержання неправдиво-негативних чи неправдиво-позитивних результатів). Для цього використовують шкалу мутності за МакФарландом. У лунках панелей знаходяться ліофілізовані біохімічні субстрати, які у разі додавання розчину досліджуваної живої культури вступають або не вступають у реакцію, внаслідок чого відбувається зміна або кольору, або мутності, або утворюються бульбашки повітря. Результати реакції можна одержати тільки після періоду інкубації (4 год., або від 18 год. до 24 год., інколи до 48 год. залежно від використовуваного протоколу роботи, за певних температурних умов).

Проведення та облік результатів досліджень – згідно з інструкцією виробника, яка додається до приладу.

Pages: 1 2 3 4 5 6 7 8 9