ДСТУ 8104:2015. Яйця харчові, продукти яєчні. Методи визначання мікробіологічних показників

Додаток Б

(обов’язковий)

Методика фарбування мазків за методом Грама

Б.1 Готування реактивів

Б.1.1 Карболовий розчин кристалічного фіолетового або генціанфіолетового

Б.1.1.1 Склад

Б.1.1.2 Готування

Кристалічний фіолетовий або генціанфіолетовий розтирають у фарфоровій ступці з кристалічною карболовою кислотою (фенолом). Під час розтирання невеликими порціями доливають етиловий спирт. Розчин фільтрують крізь вологий паперовий фільтр. Розчини генціанфіолетового або кристалічного фіолетового нестійкі, не підлягають тривалому зберіганню.

Б.1.2 Фарбувальний папір з кристалічним фіолетовим або генціан- фіолетовим у модифікації Синєва

Б.1.2.1 Склад

Б.1.2.2 Готування

Компоненти змішують, наливають у лоток або глибоку тарілку. Папір нарізають у вигляді смужок шириною від 2 см до 2,5 см і довжиною від 30 см до 50 см. Смужку занурюють на декілька секунд у барвник так, щоб змочувалися обидві її поверхні. Зафарбовані смужки виймають пінцетом, дають барвнику стекти і підвішують для висушування. Папір досушують у термостаті за температури (37±1) ^оС. Висушені смужки паперу розрізають на шматочки розміром (2х2) см або (2х4,5) см.

Б.1.3 Розчин Люголя

Б.1.3.1 Склад

Б.1.3.1 Готування

Йодид калію розчиняють у 10 см³ дистильованої води, додають кристалічний йод, залишають на кілька годин до повного розчинення йоду, після чого доливають 290 см³ дистильованої води. Розчин зберігають у хімічному посуді з темного скла.

Б.1.4 Фуксин Циля – карболовий розчин

Б.1.4.1 Склад

Б.1.4.2 Готування

Порошок фуксину розтирають у ступці з кристалічною карболовою кислотою і гліцерином. Під час розтирання невеликими порціями додають етиловий спирт. Після того, як суміш повністю буде розтертою, додають з постійним помішуванням дистильовану воду, витримують 2 доби, після чого фільтрують. Фуксин Циля стійкий, зберігається тривалий термін у флаконі з темного скла з притертим корком.

Б.1.5 Фуксин Пфейфера, спиртово-водний розчин

До 1 частини карболового розчину фуксину Циля згідно з Б.1.4 доливають 9 частин дистильованої води. Розчин нестійкий, тому його готують в необхідній кількості безпосередньо перед використанням.

Б.1.6 Дозволено застосовувати інші аналогічні реактиви та готові поживні середовища, у тому числі і закордонного виробництва, які зареєстровано в Україні, а також готових наборів реактивів для фарбування по Граму.

Б.2 Готування мазків з культури в агаризованому середовищі

На середину чистого знежиреного предметного скла стерильною піпеткою або петлею наносять невелику краплю стерильного ізотонічного розчину або стерильної води. Потім, дотримуючись правил асептики, бактеріологічною петлею або нікельованою голкою (для дуже дрібних колоній) відбирають досліджувану колонію із пробірки або чашки зі щільним поживним середовищем. Частину її занурюють у краплю, ледь розтираючи у ній, а залишок у петлі спалюють на полум’ї пальника (лабораторної спиртівки). Охолодженою петлею спочатку кінчиком, а потім усією площиною петлі рівномірним коловим рухом розподіляють краплю на площі, що становить приблизно 1/3 предметного скла.

Приготовані мазки висушують за кімнатної температури (від 18 ^оС до 20 ^оС) на повітрі. Висушені мазки фіксують сухим жаром або хімічним способом. Для фіксації сухим жаром скельце з препаратом, утримуючи мазком уверх, проводять над факелом пальника (3-4) рази. Для фіксації хімічним способом використовують етиловий спирт 96 % (час фіксації – від 15 хв. до 20 хв.), спирт-ефір (час фіксації – від 10 хв. до 15 хв.), метиловий спирт (час фіксації – від 1 хв. до 5 хв.), рідина Корна (час фіксації – від 10 хв. до 15 хв.).

Б.3 Фарбування мазків

На зафіксований полум’ям мазок кладуть смужку фільтрувального паперу, просоченого кристалічним фіолетовим або генціанфіолетовим, і на неї наливають дистильовану воду так, щоб смужка просякла повністю фарбою. Підфарбування триває від 1 хв. до 2 хв.

Фільтрувальний папір знімають пінцетом, зливають надлишок фарбника і, не промиваючи препарат водою, наливають розчин Люголя на одну чи дві хвилини до почорніння мазка.

Розчин Люголя зливають, предметне скло для знебарвлення мазка занурюють кілька разів у склянку з етиловим спиртом 96 %. Процес знебарвлення вважають закінченим, коли від мазка перестають відділятися забарвлені у фіолетовий колір цівки рідини.

Другий спосіб забарвлювання мазка: на препарат наливають етиловий ректифікований спирт 96 % на (30-60) с, при цьому препарат погойдують і доливають спирт.

Препарат ретельно промивають водопровідною водою і дофарбовують спиртово-водним розчином фуксину (Пфейфера) або 1% водним розчином нейтрального червоного протягом часу від 1 хв. до 2 хв. Фарбу зливають, мазок промивають водопровідною водою, висушують на повітрі або фільтрувальним папером і мікроскопують.

Ураховують морфологічні особливості бактерій, які вивчають, і їхнє відношення до фарби: грампозитивні бактерії зафарбовуються основною фарбою у темно-фіолетовий колір, грамнегативні, сприймаючи додаткове фарбування, набувають яскраво-рожевого забарвлення.

Pages: 1 2 3 4 5 6 7 8 9