ДСТУ 8104:2015. Яйця харчові, продукти яєчні. Методи визначання мікробіологічних показників

5 МЕТОДИ ДОСЛІДЖУВАННЯ

5.1 ВИЗНАЧАННЯ КІЛЬКОСТІ МЕЗОФІЛЬНИХ АЕРОБНИХ І ФАКУЛЬТАТИВНО-АНАЕРОБНИХ МІКРООРГАНІЗМІВ (МАФАнМ)

Метод засновано на підрахуванні усіх колоній мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів, що виростають на щільному поживному середовищі, і перерахування їхньої кількості на 1 г сухого (1 см³ рідкого) яєчного продукту.

5.1.1 Засоби та допоміжні пристрої:

• чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
• м'ясо-пептонний агар (МПА) згідно з А.7 Додатку А цього стандарту;
• поживне середовище для підрахування колоній згідно з А.8 Додатку А цього стандарту;
• покривне поживне середовище згідно з А.9 Додатку А цього стандарту;
• термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру до 55 ^оС з точністю ±0,2 ^оС, згідно з чинними нормативними документами;
• лупа зі збільшенням (2-10)х згідно з ГОСТ 25706;
• прилад для підрахування колоній бактерій ПСБ;
• піпетка градуйована згідно з ГОСТ 29227;
• олівець для скла (склограф).

Дозволено використовувати інші поживні стандартизовані середовища, діагностичні матеріали, реактиви, призначені для виконання описаного методу.

5.1.2 Методики та правила проведення досліджування

Перед посівом чашки маркують. На дні чашки маркером (олівець для скла) ставлять номер досліджуваного зразка, розведення і дату.

Варіант 1

По 1 см3 досліджуваного продукту з розведень, що приготовані згідно з 4.2, висівають паралельно у дві чашки Петрі для кожного розведення. Під час посівів кришку чашки Петрі ледь відкривають і посівний матеріал вносять на дно чашки піпеткою. Не пізніше ніж через 15 хв. після внесення досліджуваного матеріалу у чашки його заливають попередньо розтопленим і охолодженим до температури (45±1) ^оС поживним або м'ясо-пептонним агаром кількістю від 15 см3 до 20 см³. Чашки з посівами, які залиті поживним середовищем, обережно струшують коловими рухами так, щоб посівний матеріал рівномірно розподілявся по усій поверхні поживного середовища. Після застигання поживного середовища чашки з посівами перевертають догори дном та інкубують у термостаті за температури (30±1) ^оС протягом (72±3) год.

Варіант 2

У 2 стерильні чашки Петрі (бажано діаметром 90 мм) стерильною піпеткою вносять по 1 см3 рідкого яєчного продукту, вмісту цілих яєць, або по 1 см3 вихідної суспензії (розведення 10-1), одержаної згідно з 4.2, для сухих яєчних продуктів. За необхідності повторюють процедуру, з подальшими десятикратними розведеннями (згідно з 4.2.5), беручи нову стерильну піпетку для кожного розведення. У кожну чашку Петрі вносять по (12-15) см3 поживного середовища для підрахування колоній, розплавленого і охолодженого до температури від 44 ^оС до 47 ^оС. Ретельно перемішують вміст чашок, обертаючи їх коловими рухами. Одержану суміш залишають для затвердіння. Затверділе середовище заливають розплавленим і охолодженим до температури від 44 ^оС до 47 ^оС покривним поживним середовищем в об’ємі приблизно 4 см³, якщо очікують, що продукт містить таку кількість мікроорганізмів, що їхні колонії вкриють всю поверхню середовища (володіють „повзучим” ростом). Залишають до затвердіння покривного середовища, після чого чашки перевертають догори дном та інкубують у термостаті за температури (30±1) ^оС протягом (72±3) год.

5.1.3 Опрацювання результатів

Для підрахування кількості мікроорганізмів враховують усі колонії, що виросли, помічаючи їх олівцем для скла на дні чашки. Колонії, які злилися в одну або мають ланцюгову форму, враховують як одну колонію. Підрахування одиниць, які утворюють колонії (КУО), проводять неозброєним оком або за допомогою лупи чи приладом, спеціально призначеним для підрахування колоній у прохідному світлі. Результати оцінюють по кожній пробі окремо.

5.1.3.1 Підрахування мікроорганізмів (варіант 1)

Колонії підраховують на посівах того розведення, де їхня кількість знаходиться у межах від 30 до 300. За результатами підрахування обчислюють середнє арифметичне значення числа колоній із усіх посівів одного розведення.

Якщо виявлено кількість колоній від 30 до 300 колоній у посівах не одного, а двох послідовних розведень, то підраховують і обчислюють середню арифметичну кількість мікроорганізмів у кожному з цих розведень окремо. Якщо отримані результати відрізняються один від одного більше ніж у 2 рази, то оцінку проводять за результатами посіву найбільшого розведення.

Отримані результати округлюють таким чином:

• якщо інкубовані чашки не містять колоній, то результат виражають так: менше ніж 1,0 х 10 мікроорганізмів в 1 см³ або 1 г продукту;
• якщо у чашках з розведенням 1:10 виросло менше ніж 30 колоній, то результат виражають так: менше ніж 3,0 х 10;
• якщо кількість колоній, що виросли, менше ніж 100, його округлюють до найближчого числа, кратного 5;
• якщо кількість колоній більше ніж 100 і остання цифра 5, одержане число округлюють до найближчого числа, кратного 20;
• якщо число більше ніж 100 і його остання цифра не 5, його округлюють до найближчого числа, кратного 10.
• Кількість мікроорганізмів КУО в 1 г або у 1 см³ яєчних продуктів обчислюють за формулою:

де Х – кількість мікроорганізмів КУО;

а – округлене середнє арифметичне число колоній на чашках;

V – об’єм посівного матеріалу, внесеного у чашку, см³;

n – ступінь десятикратного розведення продукту.

Результати досліджувань записують таким чином: кількість мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів 1,0 х 10ⁿ КУО/г (см³)і т.д. до 9,9 х 10ⁿ КУО/г (см³) продукту.

5.1.3.2 Підрахування мікроорганізмів (варіант 2)

Відбирають чашки з двох послідовних розведень, на яких виросло від десяти до трьохсот колоній.

Для достовірного результату підраховують кількість мікроорганізмів (N) як середнє арифметичне від двох послідовних розведень за формулою:

де:

C – сума колоній, які виросли на чашках двох послідовних розведень, відібраних для врахування результату;

V – об’єм інокуляту, внесеного у кожну чашку, в см³;

0,1 – сталий коефіцієнт перерахунку;

n₁– кількість чашок першого розведення, на яких проводили підрахунок колоній;

n₂– кількість чашок другого розведення, на яких проводили підрахунок колоній;

d – ступінь першого розведення, відібраного для врахування результату.

Результат заокруглюють до двох цифр.

Результати досліджувань (кількість мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів) на 1 г чи 1 см³ яєчних продуктів записують як число між 1,0 та 9,9 помножене 10n.

Приклад. Після підраховування колоній отримано такі результати:

• у першому розведенні (10–2): 166 та 170 колоній;
• у другому розведенні (10–3): 13 та 15 колоній.

Після заокруглення отримуємо результат: кількість мікроорганізмів становить 17 000 або 1,7? 104 на 1 г чи 1 см³ яєчних продуктів.

5.2 ВИЗНАЧАННЯ БАКТЕРІЙ ГРУПИ КИШКОВИХ ПАЛИЧОК

Метод засновано на здатності бактерій групи кишкових паличок ферментувати лактозу та глюкозу з утворенням кислоти і газу.

5.2.1 Засоби та допоміжні пристрої:

• середовище Кесслера з лактозою згідно з А.10 Додатку А цього стандарту;
• середовище Хейфеца згідно з А.11 Додатку А цього стандарту;
• середовище Ендо згідно з А.35 Додатку А цього стандарту;
• середовище Левіна згідно з А.12 Додатку А цього стандарту;
• середовище Гісса з глюкозою згідно з А.13 Додатку А цього стандарту;
• термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру до 55 ^оС з точністю ±0,2 ^оС, згідно з чинними нормативними документами;
• мікроскоп марки «Биолам Д-11» або аналогічний згідно з ГОСТ 8074;
• предметні скельця згідно з ГОСТ 9284;
• пробірки скляні згідно з ГОСТ 25336;
• поплавки (трубки Дархема) згідно з чинними нормативними документами;
• піпетки згідно з ГОСТ 29227.

Дозволено використовувати інші поживні стандартизовані середовища, діагностичні матеріали, реактиви, призначені для виконання описаного методу.

5.2.2 Методика та правила проведення досліджування

По 1 см3 із розведень сухих або рідких яєчних продуктів, приготованих згідно з 4.2 цього стандарту, піпеткою вносять у пробірки із середовищем Кесслера або Хейфеца (розлиті по 5 см³ у пробірки з поплавками). Посіви інкубують за температури (43±0,5) ^оС протягом (24±1) год. Із пробірок з найменшою кількістю засіяного продукту, в якому виявлені ознаки росту бактерій (зміна кольору середовища, помутніння, газоутворення), проводять посів на середовища Ендо чи Левіна. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±1) ^оС протягом (24±1) год. Потім посіви переглядають і відзначають ріст колоній, характерних для бактерій групи кишкових паличок (пласкі або ледь випуклі, або з обідком, з різною інтенсивністю забарвлення – від блідо-рожевого до темно-червоного, часто з металевим блиском – на середовищі Ендо або колоній фіолетового кольору – на середовищі Левіна).

Для визначення наявності в колонії грамнегативних паличок роблять мазки-препарати. Препарати готують не менше ніж з 5 характерних колоній, забарвлюють за Грамом згідно з Додатком Б цього стандарту і мікроскопують. У разі виявлення типових колоній для бактерій із групи кишкової палички і грамнегативних паличок у мазках матеріал із колоній засівають у середовища Гісса з глюкозою та/або лактозою. Середовище з посівами витримують у термостаті за температури (37±1) ^оС протягом (24±1) год, після чого визначають наявність кислоти та газу у середовищі Гісса.

5.2.3 Прискорений метод визначання титру бактерій із групи кишкової палички

По 1 см³ кожного із розведень сухих або рідких яєчних продуктів, приготованих згідно з 4.2, піпеткою вносять у пробірки із середовищем Хейфеца, розлитим по 10 см³ у пробірки з поплавками. Посіви витримують у термостаті за температури (43±0,5) ^оС протягом часу від 12 год до 18 год. У разі присутності в аналізованому зразку мікроорганізмів із групи кишкових паличок спостерігають помутніння середовища, зміну його забарвлення з червоно-фіолетового у жовто-зелене і наявність газу у поплавках. Після остигання середовище набуває зеленкуватого відтінку.

5.2.4 Опрацювання результатів

Результати оцінюють по кожній пробі окремо.

Виявлення характерного росту колоній (пласкі або ледь випуклі чи з обідком, з різною інтенсивністю забарвлення – від блідо-рожевого до темно-червоного, часто з металевим блиском – на середовищі Ендо або колоній фіолетового кольору – на середовищі Левіна), наявність у мазках з цих колоній грамнегативних паличок, що зброджують лактозу та глюкозу з утворенням кислоти і газу за температури (43±0,5) ^оС, вказують на виявлення у продукті бактерій групи кишкових паличок.

Результат подають у колі-титрах, вказуючи найменшу кількість яєчного продукту, в якому виявлена кишкова паличка.

5.3 ВИЗНАЧАННЯ БАКТЕРІЙ РОДУ SALMONELLA

Метод полягає у накопиченні сальмонел у середовищі попереднього збагачення з наступною селекцією на різних диференційно-діагностичних поживних середовищах та ідентифікацією виділених мікроорганізмів за біохімічними і серологічними ознаками.

5.3.1 Засоби та допоміжні пристрої

• середовище Кауфмана згідно з А.14 або середовище магнієве згідно з А.15, або середовище селенітове (середовище Лейфсона) згідно з А.16 Додатку А цього стандарту;
• вісмут-сульфітний агар, або середовища Плоскірєва, Ендо згідно з А.35 Додатку А цього стандарту, або середовище Левіна згідно з А.12 Додатку А цього стандарту;
• МПА згідно з А.7, МПБ бульйон згідно з А.6 або пептонна вода згідно з А.17 Додатку А цього стандарту;
• середовище Ресселя згідно з А.18 Додатку А цього стандарту, або середовище Крумвіде-Олькеницького згідно з А.19 Додатку А цього стандарту, або середовище Кліглера згідно з А.20 Додатку А цього стандарту;
• середовища Гісса з вуглеводами згідно з А.13 Додатку А цього стандарту;
• фізіологічний розчин згідно з чинним нормативним документом або згідно з А.2 Додатку А цього стандарту;
• реактив Ерліха згідно з А.21 або реактив Ковача згідно з А.22 Додатку А цього стандарту;
• етиловий ефір згідно з ГОСТ 22300;
• VP-середовище згідно з А.23 Додатку А;
• розчин ?-нафтолу згідно з А.24 Додатку А;
• розчин креатину згідно з А.25 Додатку А;
• розчин гідроокису калію згідно з А.26 Додатку А;
• папір індикаторний для виявлення індолу згідно з А.27 Додатку А цього стандарту;
• ізотонічний розчин хлористого натрію згідно з А.2 Додатку А цього стандарту;
• оцтовокислий свинець (20 % розчин) згідно з А.28 Додатку А цього стандарту;
• аглютинуючі адсорбовані полівалентні сальмонельозні сироватки основних груп А, В, С, Д, Е та рідкісних груп згідно з А.29 Додатку А цього стандарту;
• піпетка пастерівська згідно з ГОСТ 29227;
• колби місткістю 250 см3 згідно з ГОСТ 1770;
• чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
• петля бактеріологічна (діаметром від 0,4 мм до 0,5 мм) згідно з чинними нормативними документами;
• предметні скельця згідно з ГОСТ 9284;
• лупа зі збільшенням (2-10)х згідно з ГОСТ 25706;
• термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру до 55 ^оС з точністю ±0,2 ^оС, згідно з чинними нормативними документами.

Дозволено використовувати інші поживні стандартизовані середовища, діагностичні матеріали, реактиви, призначені для виконання описаного методу.

5.3.2 Методика та правила проведення досліджування

5.3.2.1 Накопичення сальмонел у середовищі збагачення

5.3.2.1.1 Попереднє концентрування у неселективному рідкому середовищі

25 г сухих чи 25 см³ рідких яєчних продуктів із середньої проби з дотримуванням стерильності вносять у колбу, що містить 225 см³ буферизованої пептонної води, перемішують і інкубують у термостаті за температури (37±1) ^оС протягом часу від 16 год. до 20 год.

5.3.2.1.2 Концентрування у селективному рідкому середовищі

10 см³ культури, отриманої на середовищі попереднього концентрування, переносять у колбу, що містить 100 см³ одного з середовищ (Кауфмана, магнієвого чи селенітового), інкубують у термостаті за температури (37±1) оС протягом 24 год.

5.3.2.2 Селекція на диференційно-діагностичних поживних середовищах

Проводять посів бактеріологічною петлею із середовища селективного збагачення у чашки Петрі з вісмут-сульфітним агаром та середовищем Плоскірєва чи Левіна, розтираючи шпателем. Чашки з посівом інкубують у термостаті за температури (37±1) ^оС. Облік результатів проводять на вісмут-сульфітному агарі через 48 год, на агарі Плоскірєва і Левіна – через (18-24) год. На вісмут-сульфітному агарі сальмонели утворюють чорні або коричневі колонії з характерним металевим блиском, при цьому спостерігають забарвлювання ділянки середовища під колонією у чорний колір. На агарах Плоскірєва і Ендо утворюються прозорі, дрібні колонії рожевого кольору, на агарі Левіна – блакитні. За відсутності типових або підозрілих колоній чи за наявності слабкого росту мікробів на щільних диференціальних середовищах чашки з посівами продовжують інкубувати за температури (37±1) ^оС протягом (20-24) год. Потім знову визначають наявність колоній сальмонел. У разі виявлення підозрілих колоній продовжують досліджування. У протилежному випадку роботу з посівами припиняють.

5.3.2.3 Відбір підозрілих колоній

За наявності підозрілих типових, характерних для сальмонел колоній, з них відбирають не менше трьох колоній. Якщо на одній чашці спостерігають менше ніж 3 типові колонії, то відбирають усі підозрілі колонії, що виросли, і пересівають:

• на МПА або поживний агар, щоб одержати добові культури для мікроскопічних досліджень постановки реакції аглютинації, біохімічної ідентифікації за реакцією Фогес-Проскауера та на середовищах Гісса. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±1) ^оС протягом (24±1) год;
• у пробірки МПБ та пептонною водою – для визначення здатності виділених культур утворювати сірководень та індол;
• на одне із диференційованих середовищ Ресселя, Крумвіде-Олькеницького, Кліглера – для біохімічних досліджень (ферментація вуглеводів, розщеплення сечовини, газоутворення, утворення сірководню.

Колонії пересівають бактеріологічною петлею при робочому пальнику.

5.3.2.4 Мікроскопічні дослідження

З добових культур згідно з 5.3.2.3 готують мазки-препарати, зафарбовують за Грамом згідно з Додатком Б і мікроскопують. Сальмонели – грамнегативні палички з округлими кінцями і мають яскраво-рожевий колір.

5.3.2.5 Біохімічна ідентифікація

1. Сальмонели не ферментують лактозу і сахарозу, ферментують глюкозу з газоутворенням, утворюють сірководень, не розщеплюють сечовину.

Для визначання цих властивостей сальмонел середовища Ресселя, Крумвіде-Олькеницького, Кліглера засівають бактеріологічною петлею спочатку штрихом на похилу поверхню середовища, а потім уколом у глибину стовпчика. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±1) ^оС протягом (24±1) год.

На середовищі Ресселя оцінюють кислото- та газоутворення. Сальмонели ферментують глюкозу, внаслідок чого стовпчик середовища червоніє (у разі використання індикатора Андреде). Розриви агару або бульбашки газу вказують на утворення газу.

На середовищах Крумвіде-Олькеницького та Кліглера після інкубування посівів враховують результати ферментації лактози, глюкози і сахарози та утворення сірководню.

Зміни у середовищах, які вказують на приналежність бактерій до сальмонел:

• пожовтіння стовпчика середовища з розривом агару або бульбашки газу (ферментація глюкози з утворенням газу);
• пожовтіння стовпчика середовища без розриву або бульбашок газу (ферментація глюкози без утворення газу);
• незмінний або червоний колір поверхні середовища (відсутність ферментації лактози та сахарози);
• почорніння середовища – від темної лінії у місці проколу середовища до розлитого почорніння усього стовпчика (утворення сірководню).
• жовтий колір стовпчика середовища через ферментацію глюкози не змінюється (відсутність утворення аміаку від розщеплення сечовини).

Зміни у середовищах, які вказують на відсутність сальмонел:

• поява жовтого кольору середовища (ферментація лактози або сахарози, чи двох цукрів);
• – незмінний або червоний колір стовпчика середовища (відсутність ферментації глюкози);
• – відновлення первісного кольору (блідо-рожевого) стовпчика середовища Крумвіде-Олькеницького (розщеплення сечовини).

2. У разі необхідності визначання більш повної біохімічної характеристики культури пересівають на кольорові середовища Гісса з вуглеводами («короткий строкатий ряд» – з глюкозою, лактозою, сахарозою, манітом і мальтозою).

Сальмонели не ферментують лактозу і сахарозу, ферментують глюкозу, маніт і мальтозу з утворенням кислоти і газу.

З цією метою добову культуру, відібрану з похилої поверхні поживного або м'ясо-пептонного агару, розтирають бактеріологічною петлею в 1,0 см3 фізіологічного розчину. Потім по 2 краплі (0,2 см³) суміші вносять пастерівською піпеткою у середовища Гісса та інкубують у термостаті за температури (37±1) ^оС.

Через 24 год на середовищах Гісса визначають кислотоутворення (середовища з глюкозою, манітом і мальтозою набувають рожево-червоного кольору у разі використання індикатора Андреде, синього кольору – у разі використання індикатора ВР, жовтого кольору – у разі використання індикатора бромтимолового синього) і газоутворення (наявність бульбашок у поплавках).

3. Реакція Фогес-Проскауера. Негативна реакція свідчить про наявність сальмонел.

Культуру, відібрану згідно з 5.3.2.3, поміщають у стерильну пробірку, в якій знаходиться 0,2 см3 VP-середовища. Витримують у термостаті за температури 35 ^оС чи 37 ^оС (за узгодженням) протягом 24 год. Після цього у пробірку додають 2 краплі розчину креатину, 3 краплі розчину нафтолу в етанолі і 2 краплі розчину гідроксиду калію. Пробірку струшують після додавання кожного реактиву. Поява забарвлення від рожевого до яскраво-червоного кольору в межах 15 хв. свідчить про позитивну реакцію і відсутність сальмонел.

4. Виявлення індолу. Сальмонели індолу не утворюють.

Перший спосіб. У пробірку з м'ясо-пептонним бульйоном або пептонною водою відразу після посіву досліджуваної культури вносять смужку фільтрувального паперу, змочену насиченим водним розчином щавлевої кислоти. Смужку розташовують таким чином, щоб вона утримувалася корком, але не торкалася до середовища. За наявності індолу через (1-3) дні інкубування у термостаті за температури (37±1) ^оС нижня частина смужки зафарбовується у рожевий колір, помітний у прохідному світлі, що свідчить про відсутність сальмонел.

Другий спосіб. У пробірку з добовою бульйонною культурою обережно по стінці додають від п’яти до десяти крапель реактиву Ерліха або реактиву Ковача. Перед додаванням реактиву до бульйону можна ввести 2 см³ етилового ефіру. За наявності індолу не пізніше ніж через 5 хв. у прикордонному шарі утворюється яскраво-червоне кільце (реакція позитивна – сальмонели відсутні). Жовто-коричневе кільце вказує на негативну реакцію і наявність сальмонел.

5. Визначання утворення сірководню. Сальмонели виділяють сірководень.

У пробірку з м’ясо-пептонним бульйоном чи пептонною водою відразу після посіву досліджуваної культури під пробку поміщають смужки фільтрувального паперу, змочені 20 % розчином оцтовокислого свинцю. Вони не повинні торкатися поживного середовища. Посіви витримують у термостаті за температури (37±1) ^оС протягом часу від однієї до трьох діб. У разі виділення культурою сірководню нижня частина смужки паперу чорніє від утворення сірчистого свинцю.

5.3.2.6 Серологічне підтвердження

Серологічне підтвердження належності бактерій до роду Salmonella проводять з культурами, які дали типові біохімічні реакції відповідно до табл.1. Такі культури пересівають на поверхню м’ясо-пептонного чи поживного агару та інкубують за температури (36±1) ^оС.

Визначання самоаглютинації штамів

Краплю фізіологічного розчину поміщають на ретельно очищене предметне скельце. Диспергують, ретельно розтираючи бактеріологічною петлею, у цій краплі частину досліджуваної колонії так, щоб утворилася гомогенна і густа суспензія. Скельце обережно похитують протягом часу від 30 с до 60 с. Якщо спостерігають склеювання бактерій, тобто утворення однорідного осаду, вважають, що досліджувані колонії мають самоаглютинацію. Такі штами надалі не досліджують.

Визначання наявності 0-антигенів та Н-антигенів

Штами, у яких не виявлено самоаглютинації, першочергово досліджують у реакції аглютинації з аглютинуючими адсорбованими полівалентними сальмонельозними сироватками основних груп А, В, С, Д, Е, а потім, якщо не буде виявлено О-антигенів з сироватками основних груп, ставлять реакцію з сироватками рідкісних груп.

Готування сироваток до постановки реакції аглютинації і методику її проведення зазначено у настанові, яка прикладається до сироваток.

Аглютинація (наявність О-антигенів та Н-антигенів) проявляється у вигляді склеювання бактеріальної маси і повного або часткового просвітлення рідини.

О-аглютинат має вигляд компактних грудочок та зернинок, які важко розбиваються, Н-аглютигат – великих і пухких пластівців, які легко руйнуються.

У разі негативної реакції аглютинації культура після ретельного перемішування з краплею сироватки утворює гомогенну суміш.

5.3.3 Опрацювання результатів

Результати оцінюють за кожною пробою окремо.

5.3.3.1 Реакції, наведені у таблиці 1, підтверджують наявність Salmonella

Таблиця 1 – Біохімічні реакції, характерні для Salmonell

Тест або субстрат	Прояв реакції
Ферментація глюкози (утворення кислоти та газу)	+
Ферментація лактози та сахарози	–
Розщеплення сечовини	–
Утворювання сірководню	+
Реакція Фогес-Проскауера	–
Індольна реакція	–
Умовні познаки:(+) – позитивна реакція(-) – негативна реакція

5.3.3.2 У таблиці 2 наведено інтерпретацію біохімічних та серологічних реакцій, характерних для Salmonella.

Таблиця 2 – Інтерпретація підтверджувальних тестів

Відповідно до інтерпретації результатів вказують наявність або відсутність Salmonella у 25 г продукту.

5.4 ВИЗНАЧАННЯ БАКТЕРІЙ РОДУ PROTEUS

Метод засновано на висіванні певної кількості продукту у конденсаційну воду свіжого похилого агару, здатності бактерій роду Рroteus надавати повзучий ріст, випереджаючий інші види бактерій, і утворювати сірководень.

5.4.1 Засоби та допоміжні пристрої

• МПА згідно з А.7 Додатку А цього стандарту;
• агар сухий поживний згідно з чинними нормативними документами або агар мікробіологічний згідно з ГОСТ 17206;
• середовище Крумвіде-Олькеницького згідно з А.19, або середовище Кліглера згідно з А.20 Додатку А цього стандарту;
• пробірки скляні згідно з ГОСТ 25336;
• термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру до 55 оС з точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
• мікроскоп марки «Биолам Д-11» або аналогічний згідно з ГОСТ 8074.

Дозволено використовувати інші поживні стандартизовані середовища, діагностичні матеріали, реактиви, призначені для виконання описаного методу.

5.4.2 Методика та правила проведення досліджування

1 см3 рідких яєчних продуктів або 1 см³ з розведення 1:10, приготованих згідно з 4.2 сухих яєчних продуктів, піпеткою вносять у конденсаційну воду пробірок зі свіжим поживним або м'ясо-пептонним агаром з похилою поверхнею, не торкаючись до похилої поверхні середовища. Всі посіви проводять при робочому пальнику. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±1) оС протягом 24 год.

Під час обліку посівів звертають увагу на утворення на похилій поверхні агарі повзучого муароподібного нальоту з блакитним відтінком, який піднімається з конденсаційної рідини доверху по поверхні середовища і має різкий гнилісний запах.

У разі появи характерного росту мікробів роду Рroteus готують мазки-препарати, зафарбовують їх за Грамом згідно з Додатком Б, мікроскопують. Бактерії роду Рroteus – грамнегативні палички, які не утворюють спори.

Бактерії роду Рroteus утворюють сірководень. Для визначання здатності утворювати сірководень підозрілі культури з агару висівають методом уколювання бактеріологічною петлею у стовпчик і штрихами по похилій поверхні одного із середовищ: Крумвіде-Олькеницького чи Кліглера. Посіви витримують у термостаті за температури (37±1) оС протягом часу від 24 год. до 48 год. Почорніння середовища (від темної лінії у місці проколу середовища до розлитого почорніння усього стовпчика) вказує на утворення сірководню.

5.4.3 Опрацювання результатів

Результати оцінюють за кожною пробою окремо.

Наявність характерного росту колоній у вигляді тонкого муароподібного нальоту, що піднімається доверху від конденсату на похилій поверхні агару, різкого гнилісного запаху, утворення сірководню, наявність у мазках з цих колоній не утворюючих спор грамнегативних паличок вказують на присутність бактерій роду Рroteus в 1 см³ рідких і в 0,1 г сухих яєчних продуктів.

5.5 ВИЗНАЧАННЯ БАКТЕРІЙ STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Метод засновано на висіванні певної кількості продукту або його розведень у селективні поживні середовища, здатності стафілококів рости на середовищах з підвищеним вмістом хлористого натрію, коагулювати плазму кролика і утворювати кислоту із маніту і мальтози в анаеробних умовах.

5.5.1. Засоби та допоміжні пристрої

• сольовий бульйон згідно з А.30 Додатку А цього стандарту;
• жовтково-сольовий агар згідно з А.31 Додатку А цього стандарту, або молочно-сольовий агар згідно з А.32 Додатку А цього стандарту, або середовище Беард-Паркера згідно з ДСТУ ISO 6688-1;
• МПА згідно з А.7 Додатку А цього стандарту;
• агар сухий поживний згідно з чинними нормативними документами або агар мікробіологічний згідно з ГОСТ 17206;
• середовище з вуглеводом (манітом або мальтозою) і феноловим червоним згідно з А.33 Додатку А цього стандарту;
• цитратна плазма крові кролика згідно з А.34 Додатку А цього стандарту;
• пробірки скляні згідно з ГОСТ 25336;
• бактеріологічна петля згідно з чинними нормативними документами;
• чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
• термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру до 55 ^оС з точністю ±0,2 ^оС, згідно з чинними нормативними документами;
• мікроскоп марки «Биолам Д-11» або аналогічний згідно з ГОСТ 8074.

Дозволено використовувати інші поживні стандартизовані середовища, діагностичні матеріали, реактиви, призначені для виконання описаного методу.

5.5.2 Методика та правила проведення досліджування

5.5.2.1 Сухі яєчні продукти у кількості 1 г, рідкі – 1 см³ висівають у пробірки, що містять по 9 см3 сольового бульйону. Всі висіви треба проводити при робочому пальнику.

Через 24 год інкубування у термостаті за температури (36±1) ^оС із сольового бульйону проводять пересівання бактеріологічною петлею на чашки Петрі з підсушеним жовтково-сольовим агаром, або молочно-сольовим агаром, або середовищем Беард-Паркера. Для кожного розведення продукту використовують дві паралельних чашки Петрі. Чашки з посівами інкубують у термостаті за температури (36±1) ^оС протягом (18-24) год.

Чашки з посівами на жовтково-сольовому агарі після добової інкубації витримують на світлі за кімнатної температури протягом (18-24) год. для кращого виявлення пігментів. Чашки з посівами на молочно-сольовому агарі та середовищі Беард-Паркера продовжують інкубувати у термостаті за температури (36±1) ^оС ще (24±1) год.

На жовтково-сольовому агарі колонії Staphylococcus aureus мають форму вигнутих дисків з діаметром від 2 мм до 4 мм жовтого, білого, кремового, лимонного, золотистого кольорів, з рівними краями, навколо колоній утворюється райдужне кільце.

Типові колонії, що виросли на середовищі Беард-Паркера, чорні чи сірі, блискучі і випуклі (від 1 мм до 1,5 мм у діаметрі після інкубації через 24 год. і від 1,5 мм до 2,5 мм після інкубації через 48 год.). Колонії оточені кільцем чистої зони. У 24-годинних культур може виникати опалесценція кільця одразу після контакту з колоніями.

На молочно-сольовому агарі колонії Staphylococcus aureus круглі, з рівними краями, діаметром від 2 мм до 2,5 мм, забарвлені у жовтий, золотистий, лимонно-жовтий, кремовий або білий колір, ледь підняті над поверхнею середовища

З характерних колоній, підозрюваних на Staphylococcus aureus, готують мазки, забарвлюють за Грамом згідно з Додатком Б і мікроскопують. Колонії грам-позитивних дрібних коків, що гроноподібно розташовані у мазку, бактеріологічною петлею відсівають у чашки Петрі з поживним або м'ясо-пептонним агаром. Посіви інкубують у термостаті за температури (36±1) оС протягом часу від 18 год до 24 год.

5.5.2.2 З підозрюваних на Staphylococcus aureus колоній, що виросли на агарі, після перевіряння мазків на чистоту культури під мікроскопом ставлять реакцію плазмокоагуляції. Для цього у пробірку з 0,5 см³ розбавленої цитратної плазми кролика вносять петлею досліджувану добову агарову культуру, іншу пробірку залишають незасіяною або засівають коагулазопозитивним стафілококом як контрольну. Пробірки поміщають у термостат за температури (37±1) ^оС. Облік результатів проводять через (2-4) год. і пробірки залишають до ранку за кімнатної температури (від 18 ^оС до 20 ^оС) до остаточного обліку. Пробірки треба продивлятися обережно, щоб не зруйнувати утворений згусток.

Під час обліку реакції плазмокоагуляції можна спостерігати три ступеня активності ферменту коагулази:

++++ – згусток щільний, у разі нахилу пробірки нерухомий;

+++ – згусток, що має невеликий відсік, у разі нахилу пробірки нерухомий, щільна коагуляція плазми;

++ – згусток у вигляді завислого мішечка, неповна коагуляція плазми з утворенням рухомого згустку у центрі плазми.

Усі три варіанти є позитивним результатом і свідчать про наявність Staphylococcus aureus.

5.5.2.3 Підозрювані на Staphylococcus aureus колонії, що виросли на жовтково-сольовому агарі (молочно-сольовому агарі, середовищі Беард-Паркера), бактеріологічною петлею пересівають у чашки Петрі з агаризованим середовищем з манітом (або мальтозою) та індикатором феноловим червоним. Посіви витримують у термостаті за температури (36±1) ^оС протягом часу від 18 год до 24 год. У разі позитивної реакції навколо колонії спостерігають жовте забарвлювання середовища, яке чітко контрастує з пурпурово-червоним фоном.

5.5.3 Опрацювання результатів

Результати оцінюють по кожній пробі окремо.

Наявність грампозитивних гроноподібно розташованих дрібних коків у мазках, зроблених з характерних колоній на жовтково-сольовому агарі (молочно-сольовому агарі, середовищі Беард-Паркера), позитивна реакція плазмокоагуляції, ферментація маніту і мальтози з утворенням кислоти свідчить про виявлення в 1 г або в 1 см³ яєчних продуктів Staphylococcus aureus.

6 ВИМОГИ ЩОДО БЕЗПЕКИ

6.1 Під час роботи у лабораторіях ветеринарної медицини та лабораторіях птахівницьких підприємств треба дотримуватися вимог ДНАОП 2.1.20-1.03 [1], правил [2] та ДСП 9.9.5.-080 [3].

6.2 Працівники ветеринарних лабораторій мають бути ознайомлені з правилами техніки безпеки під час роботи з хімічними, легкозаймистими, вибухонебезпечними речовинами. Всі роботи з небезпечними реактивами проводять у витяжній шафі.

6.3 Під час проведення лабораторних досліджень працівники ветеринарних лабораторій повинні бути забезпечені спецодягом, засобами індивідуального захисту.

6.4 Під час роботи з хімічними реактивами треба дотримуватися вимог безпеки згідно з ГОСТ 12.1.007.

6.5 З приладами треба працювати згідно з вимогами нормативно-технічних документів на них.

6.6 Мікроклімат виробничих приміщень повинен відповідати загальним санітарно-гігієнічним вимогам ДСН 3.3.6.042 [4].

6.6.1 У приміщеннях лабораторій треба систематично контролювати загазованість, мікробну забрудненість, при цьому ураховуючи граничні концентрації для людей згідно з ГОСТ 12.1.008.

6.6.2 Повітря робочої зони повинно відповідати загальним санітарно-гігієнічним вимогам згідно з ГОСТ 12.1.005 та ДСТУ ГОСТ ИСО 14644-1.

6.7 Пожежна безпека повинна відповідати вимогам ГОСТ 12.1.004.

6.8 Вимоги до електробезпеки – згідно з ГОСТ 12.1.019.

7 ВИМОГИ ОХОРОНИ ДОВКІЛЛЯ

7.1 Стічні води після проведення лабораторних досліджень підлягають очищенню і повинні відповідати СанПиН № 4630 [5] .

7.2 Максимально допустимі рівні шкідливих речовин в атмосфері контролюють згідно з ГОСТ 17.2.3.01 і ДСП 201 [6].

7.3 Охорону ґрунту від забруднення здійснюють відповідно до вимог СанПиН 42-128-4690 [7].

Pages: 1 2 3 4 5 6 7 8 9