Ukrainian Dutch English French Italian Polish Russian Turkish
Птахівництво України і cвіту | менеджмент, аналітика, реформи, стандарти


Птиця сільськогосподарська методи лабораторної діагностики вірусного гепатиту качок

5 Методи ЛАБОРАТОРНОЇ ДІАГНОСТИКИ

5.1 Для діагностики ВГК використовують такі лабораторні методи:

  • вірусологічний;
  • серологічні (реакція нейтралізації, реакція імунофлуоресценції, реакція дифузної преципітації);
  • диференційна діагностика.

5.2 Вірусологічний метод

Суть методу полягає в ізолюванні та ідентифікації збудника захворювання на курячих, качиних ембріонах або на каченятах віком від 1 дня до 7 днів.

5.2.1 Засоби та допоміжні пристрої

  • ступки фарфорові згідно з ГОСТ 9147;
  • пробірки скляні місткістю 10 см3, 15 см3 і 20 см3 згідно з ГОСТ 25336;
  • колби або хімічні стакани згідно з ГОСТ 25336;
  •  центрифуга лабораторна типу “ОС-6М” або інших модифікацій, яка забезпечує частоту обертів не менше ніж 3000 об/хв згідно з чинними нормативними документами;
  •  термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 оС до 55 оС з точністю +0,5оС, або лабораторний інкубатор, що забезпечує температуру нагрівання від 37 оС до 38 оС, згідно з чинними нормативними документами;
  • овоскоп настільний марки И-11А для просвічування яєць згідно з чинними нормативними документами;
  • шприци згідно з ГОСТ 22967;
  • голки згідно з ГОСТ 25377;
  • курячі ембріони від 8-добового до 10-добового віку або ембріони качок від 10-добового до 14-добового віку (вільні від специфічних антитіл до ВГК);
  • каченята віком від 1 дня до 7 днів;
  • стрептоміцин, пеніцилін, гентаміцин згідно з [3];
  • вакцина БЦЖ згідно з чинними нормативними документами;
  • ізотонічний розчин, утримуючий 0,89 % хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4);
  • середовища поживні (МПБ, МПА, Сабуро, Кітта-Тароцці) згідно з чинними нормативними документами;
  • вакцинний штам вірусу гепатиту качок згідно з чинними нормативними документами;
  • ланолін згідно з чинними нормативними документами;
  • вазелінове масло згідно з чинними нормативними документами.

5.2.2 Правила готування до досліджування

5.2.2.1 Готування проб

Проби органів і тканин розтирають у стерильній ступці в ізотонічному буферному розчині у співвідношенні 1:10 і екстрагують протягом 2 год за температури 4 °С. Суспензію центрифугують з частотою обертів від 1500 об/хв до 2000 об/хв протягом 15 хв. Для знезаражування надосадової рідини від бактеріальної мікрофлори вносять 1000 ОД/см3 пеніциліну, 1000 мкг/см3 стрептоміцину і 500 мкг/см3 гентаміцину та витримують за кімнатної температури (від 18 оС до 20 оС) протягом 1 год.

5.2.2.2 Отримання сироватки крові качок-реконвалесцентів

Кров відбирають під час забивання качок у стерильний посуд (колба, склянка), зрошений ізотонічном розчином. Отримані згустки крові поміщають у марлю, зав’язують і підвішують над стаканом для збирання сироватки крові. В отриману сироватку крові додають антибіотики (пеніцилін, стрептоміцин по 10 тис. ОД на 1 см3 сироватки), після чого її перевіряють на стерильність шляхом посіву на поживні середовища (МПБ, МПА, Сабуро, Кітта-Тароцці).

5.2.2.3 Готування ад’юванту Фрейнда

Повний ад’ювант Фрейнда

До 5,24 г ланоліну додають 16,99 г вазелінового масла і 20 мг живої культури мікобактерій (вакцина БЦЖ із штаму мікобактерій). Ад’ювант готують із розрахунку 1 мг отриманої суміші на 1 см3 ізотонічного розчину.

Неповний ад’ювант Фрейнда

Використовують вбиту культуру мікобактерій замість живої культури.

Перед імунізацією антиген змішують з ад’ювантом у рівних об’ємах. Перед введенням суміш антигена з ад’ювантом треба тримати у посудині з теплою водою, щоб уникнути застигання.

5.2.2.4 Отримання гіперімунної сироватки крові кроля до вірусу гепатиту качок типу 1.

Для проведення досліджування використовують кролів масою не менше ніж 3 кг, вірус гепатиту качок типу 1 з титром не нижче 106,2 ЕІД/см3, ад’ювант Фрейнда.

В якості антигену використовують вірус гепатиту качок, розмножений на курячих ембріонах від 8-добового до 10-добового віку або на качиних ембріонах від 10-добового до 14-добового віку.

Кров для визначання титру антитіл відбирають від кролів до імунізації та через 10 діб після кожного введення антигену.

Гіперімунізацію кролів проводять тричі. За 7 діб до першого введення антигену п’яти піддослідним кролям у зону підшкірних лімфатичних вузлів вводять по 1 см3 ад’юванту Фрейнда. Через 7 діб у підколінні лімфовузли вводять по 0,2 см3 суміші антигену з рівним об’ємом ад’юванту Фрейнда. Через 30 діб проводять реімунізацію, вводячи по 500 мкг вірусного білка кожному кролю в область підколінних та передлопаткових лімфовузлів. Через 10 діб проводять третю інокуляцію антигену в дозі 500 мкг на голову у лімфатичні вузли задніх кінцівок та по 500 мкг – внутрішньовенно. Через 10 діб після останнього введення антигену кролів знекровлюють.

5.2.3 Методика та правила проведення досліджування

Оброблену антибіотиками досліджувану надосадову рідину перевіряють на стерильність шляхом посіву на поживні середовища (МПБ, МПА, Сабуро, Кітта-Тароцці) і вводять в об’ємі 0,2 см3 через повітряну камеру в алантоїсну порожнину десяти курячим ембріонам віком від 8 діб до 10 діб або ембріонам качок віком від 10 діб до 14 діб.

Заражені ембріони інкубують у термостаті або лабораторному інкубаторі за температури 37,5 оС і відносної вологості від 60 % до 70 % протягом 120 год і овоскопують 2 рази на добу. Загибель ембріонів протягом 24 год після зараження вважають неспецифічною і під час подальших досліджень не ураховують. Ембріони, що загинули після 24 год вилучають з інкубатора і охолоджують у холодильній камері протягом 24 год, після чого їх обробляють 5 % спиртовим розчином йоду або 70 % етиловим спиртом, розтинають з боку повітряної камери і відбирають екстраембріональну рідину для ідентифікації вірусу.

Ідентифікацію вірусу гепатиту качок проводять на курячих ембріонах віком від 8 діб до 10 діб у реакції нейтралізації (РН), використовуючи сироватку качок-реконвалесцентів або гіперімунну сироватку кроля.

5.2.4 Правила опрацювання результатів

За наявності вірусу гепатиту ембріони курей гинуть у період від 2 діб до 5 діб, ембріони качок – у період від 1 доби до 4 діб, каченята – у період від 1 доби до 7 діб.

Найбільш виражені макроскопічні зміни відмічають у 9-добових ембріонів качок, які інфіковані в алантоїсну порожнину вірулентним штамом вірусу гепатиту качок: гіперемія з багатьма крововиливами на тулубі, голові і кінцівках ніг; гепатит, нефрит, пневмонія.

5.3 Біопробу ставлять на каченятах віком від 1 доби до 2 діб, які отримані із птахогосподарств, благополучних щодо вірусного гепатиту і паратифу качок. Вірусоутримуючий матеріал у розведенні від (1:20) до (1:50) вводять внутрішньом’язово, інтраназально або підшкірно у дозі від 1 см3 до 3 см3. Через період від 2 діб до 5 діб каченята гинуть з наявністю судорог. У загиблих каченят виявляють: збільшення і жовтяничність печінки з дрібними крововиливами на поверхні (від крапчастих до дифузних), переповнення жовчю жовчного міхура, анемію нирок, гіперемію і набряк головного мозку.

5.4 Серологічний метод – реакція нейтралізації (РН)

Суть методу полягає у виявленні у перехворілої або у вакцинованої птиці специфічних антитіл в реакції нейтралізації (РН).

5.4.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  баня водяна;
  •  термометр скляний рідинний згідно з ГОСТ 28498 або ртутний згідно з ГОСТ 13646 з діапазоном вимірювання від 0 оС до 100 оС з межею допустимої похибки вимірювання ±1 оС;
  •  термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 оС до 55 оС, з межею допустимої похибки встановлення температури +0,5 оС;
  • центрифуга лабораторна типу “ОС-6М” або інших модифікацій, яка забезпечує частоту обертів не менше ніж 3000 об/хв;
  • холодильна камера згідно з чинними нормативними документами;
  • пробірки місткістю 10 см3, 15 см3 і 20 см3 згідно з ГОСТ 25336;
  • піпетки градуйовані місткістю 1 см3, 2 см3, 5 см3 і 10 см3 згідно з ГОСТ 20292;
  • флакони медичні місткістю 100 см3 згідно з чинними нормативними документами;
  • чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
  • пеніцилін згідно з [3];
  • стрептоміцин згідно з [3];
  • спирт етиловий ректифікований згідно з ДСТУ 4221;
  • йод згідно з ГОСТ 4159 (5 % спиртовий розчин);
  • курячі ембріони 9-добового віку або10-денні качині ембріони;
  • ізотонічний розчин, утримуючий 0,89 % хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4);
  • сироватки типоспецифічні до вірусного гепатиту качок, позитивні;
  • дезінфікувальний розчин згідно з чинними нормативними документами;
  • агар «Діфко» згідно з чинними нормативними документами;
  • мертіолят згідно з чинними нормативними документами.

5.4.2 Правила готування до досліджування

5.4.2.1 Готування до досліджування сироваток крові

Проби сироватки крові інактивують прогріванням на водяній бані за температури 56 °С протягом 30 хв. З метою отримання стерильної сироватки крові її обробляють антибіотиками.

5.4.2.2 Титрування вірусу

У 10 пробірок вносять по 9 см3 ізотонічного розчину. У першу пробірку додають 1 см3 вірусу і ретельно перемішують, отримують розведення 1:10 (10-1). Далі піпеткою з першої пробірки 1 см3 розведеного вірусу вносять у другу пробірку для отримання розведення 1:100 (10-2); з другої – 1 см3 переносять у третю і т.д., поки останнє розведення буде дорівнювати 1:100000000 (10-8). Кожне розведення вірусу роблять окремими піпетками і перевіряють на контамінацію бактеріальною і грибковою мікрофлорою шляхом посіву на поживні середовища (МПБ, МПА, Сабуро, Кітта-Тароцці), витримуючи у термостаті за температури 37,5 оС протягом 10 діб.

Кожним розведенням вірусу, починаючи з останнього розведення (з 10-8 до 10-1), заражають по чотири 9-добових ембріони курей або 10-добові качині ембріони в алантоїсну порожнину в дозі 0,2 см3. Перед зараженням поверхню яйця у місці уколу в повітряну камеру та у місці введення вірусу обробляють фламбуванням 70 % спиртом або 5 % спиртовим розчином йоду.

Розведення вірусу, яке викликає 50 % загибелі ембріонів визначає його інфекційний титр.

5.4.3 Методика та правила проведення досліджування в РН

Для постановки РН використовують вірус з титром не нижче від 105,5 ЕІД 50/0,2 см3. Вірус починають розводити з 10-1, отримуючи розведення 10-3 (у розведенні 1:1000), яка є постійною дозою вірусу.

Готують розведення антибіотиків у ізотонічному розчині з рН 7,2 таким чином: у флакон на 100 см3 вносять 50 см3 ізотонічного розчину і добавляють (із розрахунку на 1 см3) по 1000 ОД стрептоміцину і пеніциліну, тобто на 50 см3 необхідно по 100000 ОД антибіотика. Розведені в ізотонічному розчині антибіотики вносять по 2 см3 у кожну з 10 пробірок.

Готують двократні розведення інактивованих сироваток крові, одержаних згідно 5.4.2.1, починаючи з розведення 1:2, і до 1:256, для чого у 8 пробірок наливають по 2 см3 фізіологічного розчину (рН від 7,2 до 7,4) з антибіотиками по 1000 ОД/см3. У першу пробірку з розведеними антибіотиками вносять 2 см3 досліджуваної сироватки крові качок, добре перемішують і 2 см3 переносять у другу пробірку і т.д. до останньої пробірки, з якої 2 см3 видаляють у дезінфікувальний розчин.

До розведеної сироватки крові у кожну пробірку додають по 2 см3 вірусу (ВГК) з постійною дозою 10-3.

Суміш вірусу з розведеними сироватками ставлять у термостат за температури 37 оС на 30 хв або залишають на 1 год за кімнатної температури (від 18 оС до 20 оС).

Кожним розведенням суміші інокулюють по 4 курячих ембріони 9-добового віку або 10-добові качині ембріони в алантоїсну порожнину в дозі 0,2 см3. Інокульовані ембріони овоскопують щоденно протягом часу від 5 діб до 7 діб; ембріони, які загинули протягом перших 24 год, не ураховують і утилізують.

При постановці РН ставлять такі контролі:

1) контроль вірусу (2 см3 вірусу з постійною дозою 10-3 і 2 см3 фізіологічного розчину);

2) контроль сироватки (2 см3 досліджуваної сироватки у розведенні 1:2 змішують з 2 см3 фізіологічного розчину);

3) фізіологічний розчин.

Результати титрування вірусонейтралізуючих антитіл з постійною дозою вірусу наведено у таблиці.

Таблиця – Титрування вірусонейтралізуючих антитіл з постійною дозою вірусу

Компоненти

Розведення сироватки

Контроль

1:4

1:8

1:16

 

 

1:32

 

 

1:64

 

 

1:128

1:512

вірус плюс

фізрозчин

досліджувана сироватка 1:2 плюс фізрозчин

фізрозчин

Досліджувана сироватка плюс вірус гепатиту качок постійною дозою 10-3

 

 

–+

 

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Примітка. Позначення:

– відсутність загибелі ембріонів;

+ загибель ембріонів

5.4.4 Правила опрацювання результатів

У разі наявності у досліджуваних сироватках специфічних антитіл до вірусу гепатиту качок, вони будуть нейтралізувати вірус. Результат РН обчислюють за здатністю антитіл сироватки запобігати загибелі ембріонів.

Критерій оцінки імунітету у вакцинованих качок: титр 1:32 і вище є показником імунітету. Розведення 1:32 – слабка ступінь імунітету; від 1:64 до 1:128 – середня; 1:256 і вище – ступінь імунітету висока.

Різниця між логарифмами титру контрольного ряду вірусу і титру суміші вірусу з досліджуваною сироваткою виражає індекс нейтралізації.

Якщо одержані значення індексу нейтралізації від 0 до 1,0, результат реакції вважають негативним, від 1,1 до 2,0 – сумнівним, від 2,1 і вище – позитивним.

5.5 Реакція імунофлуоресценції (РІФ)

Суттю методу є використання антитіл (антигену), які кон’юговані флуорисцуючими речовинами.

5.5.1 Засоби та допоміжні пристрої

  1. ацетон згідно з ГОСТ 2603-79;
  2. спирт етиловий згідно з ДСТУ 4221;
  3. специфічний флуоресцуючий гама-глобулін згідно з чинними нормативними документами;
  4. забуферений ізотонічний розчин згідно з чинними нормативними документами;
  5. гіперімунна сироватка крові кроля;
  6. вода дистильована згідно з ГОСТ 6709;
  7. чашки бактеріологічні згідно з ГОСТ 19908;
  8. термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 оС до 55 оС з точністю (+0,5) оС;
  9. мікроскоп марки “Биолам Д-11” або аналогічний згідно з ГОСТ 8074;
  10. папір фільтрувальний лабораторний (ФС1-4, СС15-2, БС8-2) згідно з ГОСТ 12026.

5.5.2 Методика та правила проведення досліджування

5.5.2.1 Непрямий метод

Суттю методу є використання немічених антитіл, які виявляють за допомогою мічених антиглобулінових антитіл.

Мазки-відбитки готують з поверхні розрізу тканин, слизових оболонок, а також невеликої кількості розтертої тканини або краплі досліджуваної рідини. Препарати висушують, фіксуючи ацетоном протягом 10 хв за температури 4 оС або етиловим спиртом 70 % протягом 15 хв за кімнатної температури, після чого на них наносять гіперімунну сироватку крові кроля у розведеннях від 1:1 до 1:160, витримують у вологій камері (у бактеріологічну чашку з препаратами поміщають фільтрувальний папір, змочений проточною водою) у термостаті за температури 37,5 оС протягом 30 хв і двічі по 10 хв промивають забуференим ізотонічним розчином хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4). Мазки-відбитки просушують за кімнатної температури (приблизно 20 оС), після чого на них наносять люмінесчуючу сироватку відповідно проти глобулінів сироватки крові кроля, яку перед використанням розводять 1:100, витримують у вологій камері протягом 20 хв, двічі промивають по 10 хв ізотонічним розчином хлористого натрію і підсушують за кімнатної температури.

5.5.2.2 Прямий метод

Реакція відбувається між міченим (флуорохромом) антитілом і антигеном.

На препарат, приготований як у 5.5.2.1, наносять 2 краплі чи 3 краплі кон’югату у розведенні від 1:4 до 1:8 і фарбують протягом 30 хв за температури 37 оС у вологій камері (у бактеріологічну чашку з препаратами поміщають фільтрувальний папір, змочений водою). Потім промивають буферним ізотонічним розчином (рН 7,2) протягом від 20 хв до 30 хв, прополіскують у дистильованій воді, висушують і розглядають під мікроскопом.

5.5.3 Правила опрацювання результатів

У реакції імунофлуоресценції в прямій і непрямій модифікаціях у фіксованих ацетоном мазках-відбитках із печінки, селезінки виявляють цитоплазматичне жовто-зеленого кольору світіння специфічного антигену.

5.6 Реакція дифузної преципітації (РДП)

Суттю реакції є визначання наявності специфічних антитіл у сироватці крові перехворілої птиці або наявність вірусу у сироватці хворої птиці чи у патологічному матеріалі загиблої птиці.

5.6.1 Засоби та допоміжні пристрої

  • предметне скло згідно з ГОСТ 6672;
  • чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
  • пеніцилін згідно з [3];
  • стрептоміцин згідно з [3];
  • агар «Діфко» згідно з чинними документами або агар мікробіологічний згідно з ГОСТ 17206;
  • антиген (вірус або рідина культури тканин печінки, яка утримує вірус);
  • контрольний антиген згідно з чинними нормативними документами;
  • дослідні сироватки крові;
  • гіперімунні сироватки крові згідно з чинними нормативними документами;
  • нормальні сироватки крові коней або качок згідно з чинними нормативними документами;
  • ізотонічний розчин згідно з чинними нормативними документами;
  • мертіолят згідно з чинними нормативними документами;
  • натрій хлористий згідно з ГОСТ 4233;
  • вода дистильована згідно з ГОСТ 6709;
  • натрію гідроокис згідно з ГОСТ 4328;
  • ексикатор згідно з чинними нормативними документами;
  • фільтрувальний папір згідно з чинними нормативними документами;
  • планшет згідно з чинними нормативними документами;
  • марля медична згідно з ГОСТ 9412;
  • термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 оС до 55 оС з точністю +0,5оС;
  • циліндри скляні згідно з ГОСТ 25336.

5.6.2 Правила готування до досліджування

5.6.2.1 Для постановки РДП використовують знежирене предметне скло або чашки Петрі. На склі роблять мазок із краплі розплавленого (1,0-1,5) % агару «Діфко» на ізотонічному розчині або мікробіологічного агару з додаванням мертіолята 1:10000, а потім рівномірним шаром товщиною від 2 мм до 3 мм наливають ще 2,5 см3 розплавленого агару. Після того як агар застигне, порожнистими тонкостінними циліндрами з діаметром від 3 мм до 4 мм видавлюють на ньому в три ряди луночки, розташовуючи їх у шаховому порядку на відстані від 3 мм до 4 мм одна від іншої. Після застигання шаблони обережно виймають, залишаючи в агарі круглі рівні луночки.

5.6.2.2 Готування агарового середовища „Діфко”

Агар „Діфко” – 1 г, натрій хлористий – 8 г, дистильована вода – 100 см3. Суміш автоклавують з тиском в 1 атм протягом 30 хв, потім фільтрують через 2 шари марлі і доводять рН суміші від 7,2 до 7,4 розчином гідроокису натру 10 %. Середовище консервують мертіолятом (0,01 % до загального об’єму) і зберігають за температури 4 оС протягом 14 діб.

5.6.2.3 Компоненти реакції

1 Антиген нерозведений – рідина культури тканини печінки каченят, інфікованих вірусом гепатиту качок типу 1.

2 Антиген контрольний – рідина нормальної культури тканини печінки каченят.

3 Дослідні сироватки крові свіжі або консервовані борною кислотою, без еритроцитів і слідів гемолізу.

4 Дослідні екстракти із тканин печінки хворих або загиблих каченят, готують так: 10 % суспензію тканини печінки на ізотонічному розчині 5 разів заморожують у холодильній камері до температури мінус 70 оС і відтаюють у водяній бані за температури 3 оС, потім центрифугують при 2,5 тис об/хв. Прозорий центрифугат використовують як антиген.

5 Специфічні гіперімунні сироватки крові качок-реконвалесцентів з титром не нижче 1: 64 в РН.

6 Нормальна сироватка крові коней або качок.

5.6.2.4 Дослідні сироватки крові одночасно досліджують як на наявність вірусу інфекційного гепатиту, так і на наявність специфічних антитіл; дослідні екстракти із органів досліджують тільки з гіперімунною сироваткою на наявність вірусу.

5.6.3 Методика та правила проведення досліджування

З метою досліджування дослідних сироваток луночки середнього ряду почергово через одну заповнюють гіперімунною і нормальною сироватками, а луночки нижнього ряду в такому самому порядку заповнюють контрольним і специфічним антигеном; луночки середнього ряду послідовно заповнюють дослідними сироватками.

За такою самою чергою ставлять контроль з гіперімунною і нормальною сироватками.

З метою досліджування екстрактів у всі луночки верхнього ряду розливають гіперімунну сироватку, нижнього – нормальну сироватку, а в середній ряд також послідовно розливають дослідні екстракти і у дві останні лунки – для контролю специфічний та нормальний антигени. Потім скло кладуть у вологу камеру (чашки Петрі в ексикаторі зі змоченими водою шматочками вати або фільтрувального паперу). За кімнатної температури (приблизно 20 оС) реакція протікає від 24 год до 5 діб; у термостаті за температури 37 оС – протягом 24 год.

5.6.4 Правила опрацювання результатів

Реакцію вважають позитивною у разі появи білувато-матових ліній (однієї або двох) між лунками антиген-сироватка. Утворення преципітаційної лінії між лунками з антигеном і дослідною сироваткою вказує на наявність антитіл у крові птиці до вірусу гепатиту качок. Утворення преципітаційної лінії між лунками з дослідною сироваткою (або екстрактом) і гіперімунною сироваткою вказує на наявність у сироватці крові або екстракті вірусу гепатиту качок.

5.7 Диференційна діагностика ВГК

Суттю досліджування є диференціація ВГК від інших захворювань інфекційної та неінфекційної природи.

5.7.1 ВГК треба відрізняти від паратифу, ботулізму, вірусного ентериту качок, ньюкаслської хвороби та кормових отруєнь.

5.7.2 ВГК від інших захворювань диференціюють на підставі результатів бактеріологічних, вірусологічних досліджувань з виділенням вірусу гепатиту каченят типу 1.

5.7.3 ВГК від кормових отруєнь диференціюють використанням токсикологічних досліджувань.

Pages: 1 2 3 4 5

Залишити відповідь

Ваша e-mail адреса не оприлюднюватиметься. Обов’язкові поля позначені *

:wink: :twisted: :roll: :oops: :mrgreen: :lol: :idea: :evil: :cry: :arrow: :?: :-| :-x :-o :-P :-D :-? :) :( :!: 8-O 8)