Ukrainian Dutch English French Italian Polish Russian Turkish
Птахівництво України і cвіту | менеджмент, аналітика, реформи, стандарти


Птиця сільськогосподарська. Методи лабораторної діагностики сальмонельозу

Додаток Б

(обов’язковий)

МЕТОДИКА ФАРБУВАННЯ МАЗКІВ ЗА МЕТОДОМ ГРАМА

Б.1 Готування реактивів

Б.1.1 Карболовий розчин кристалічного фіолетового або генціанфіолетового

Б.1.1.1 Склад

Назва складника

Кількість

Нормативний документ

Кристалічний фіолетовийабоГенціан фіолетовий

1 г

Згідно з чинними НД

Кислота карболова кристалічна (фенол)

2 г

ГОСТ 6417

Спирт етиловий ректифікований 96 %

10 см3

ДСТУ 4221

Б.1.1.2 Готування

Кристалічний фіолетовий або генціанфіолетовий розтирають у фарфоровій ступці з кристалічною карболовою кислотою (фенолом). Під час розтирання невеликими порціями доливають етиловий спирт. Розчин фільтрують крізь вологий паперовий фільтр. Розчини генціанфіолетового або кристалічного фіолетового нестійкі, не підлягають тривалому зберіганню.

Б.1.2 Фарбувальний папір з кристалічним фіолетовим або генціанфіолетовим у модифікації Синьова

Б.1.2.1 Склад

Назва складника

Кількість

Нормативний документ

Кристалічний фіолетовийабоГенціанфіолетовий

1 г

Згідно з чинними НД

Спирт етиловий ректифікований 96 %

100 см3

ДСТУ 4221

Гліцерин, х.ч.

5 см3

ГОСТ  6824

Б.1.2.2 Готування

Компоненти змішують, наливають у лоток або глибоку тарілку. Папір нарізають у вигляді смужок шириною від 2 см до 2,5 см і довжиною від 30 см до 50 см. Смужку занурюють на декілька секунд у барвник так, щоб змочувалися обидві її поверхні. Зафарбовані смужки виймають пінцетом, дають барвнику стекти і підвішують для висушування. Папір досушують у термостаті за температури (37±1) оС. Висушені смужки паперу розрізають на шматочки розміром (2х2) см або (2х4,5) см.

Б.1.3 Розчин Люголя

Б.1.3.1 Склад

Назва складника

Кількість

Нормативний документ

Калію йодид (КІ)

2 г

ГОСТ 4232

Вода дистильована  300 см3

ГОСТ  6709,

ДСТУ ISO 3696

Йод кристалічний

1 г

ГОСТ 4159

Б.1.3.2 Готування

Йодид калію розчиняють у 10 см3 дистильованої води, додають кристалічний йод, залишають на кілька годин до повного розчинення йоду, після чого доливають 290 см3 дистильованої води. Розчин зберігають у хімічному посуді з темного скла.

Б.1.4 Фуксин Циля – карболовий розчин

Б.1.4.1 Склад

Назва складника

Кількість

Нормативний документ

Фуксин

1 г

Згідно з чинними НД

Кислота карболова кристалічна (фенол)

5 г

ГОСТ 6417

Гліцерин

0,5 см3

ГОСТ  6824

Спирт етиловий ректифікований 96 %

10 см3

ДСТУ 4221

Вода дистильована  100 см3

ГОСТ  6709,

ДСТУ ISO 3696

Б.1.4.2 Готування

Порошок фуксину розтирають у ступці з кристалічною карболовою кислотою і гліцерином. Під час розтирання невеликими порціями додають етиловий спирт. Після того, як суміш повністю буде розтертою, додають з постійним помішуванням дистильовану воду, витримують 2 доби, після чого фільтрують. Фуксин Циля стійкий, зберігається тривалий термін у флаконі з темного скла з притертим корком.

Б.1.5 Фуксин Пфейфера, спиртово-водний розчин

До 1 частини карболового розчину фуксину Циля згідно з Б.1.4 доливають 9 частин дистильованої води. Розчин нестійкий, тому його готують в необхідній кількості безпосередньо перед використанням.

Б.1.6 Дозволено застосування інших аналогічних реактивів та готових поживних середовищ, у тому числі і закордонного виробництва, які зареєстровано в Україні, а також готових наборів реактивів для фарбування по Граму.

Б.2 Готування мазків з культури в агаризованому середовищі

На середину чистого знежиреного предметного скла стерильною піпеткою або петлею наносять невелику краплю стерильного ізотонічного розчину або стерильної води. Потім, дотримуючись правил асептики, бактеріологічною петлею або нікельованою голкою (для дуже дрібних колоній) відбирають досліджувану колонію із пробірки або чашки зі щільним поживним середовищем. Частину її занурюють у краплю, ледь розтираючи у ній, а залишок у петлі спалюють на полум’ї пальника (лабораторної спиртівки). Охолодженою петлею спочатку кінчиком, а потім усією площиною петлі рівномірним коловим рухом розподіляють краплю на площі, що становить приблизно 1/3 предметного скла.

Приготовані мазки висушують за кімнатної температури (від 18 оС до 20 оС) на повітрі. Висушені мазки фіксують сухим жаром або хімічним способом. Для фіксації сухим жаром скельце з препаратом, утримуючи мазком уверх, проводять над факелом пальника (3-4) рази. Для фіксації хімічним способом використовують етиловий спирт 96 % (час фіксації – від 15 хв. до 20 хв.), спирт-ефір (час фіксації – від 10 хв. до 15 хв.), метиловий спирт (час фіксації – від 1 хв. до 5 хв.), рідина Корна (час фіксації – від 10 хв. до 15 хв.).

Б.3 Фарбування мазків

На зафіксований мазок кладуть смужку фільтрувального паперу, просоченого кристалічним фіолетовим або генціанфіолетовим, і на неї наливають дистильовану воду так, щоб смужка просякла повністю фарбою. Підфарбування триває від 1 хв. до 2 хв.

Фільтрувальний папір знімають пінцетом, зливають надлишок фарбника і, не промиваючи препарат водою, наливають розчин Люголя на одну чи дві хвилини до почорніння мазка.

Розчин Люголя зливають, предметне скло для знебарвлення мазка занурюють кілька разів у склянку з етиловим спиртом 96 %. Процес знебарвлення вважають закінченим, коли від мазка перестають відділятися забарвлені у фіолетовий колір цівки рідини.

Мазок можна знебарвлювати ще таким способом: на препарат наливають етиловий ректифікований спирт 96 % на (30-60) с, при цьому препарат погойдують і доливають спирт.

Препарат ретельно промивають водопровідною водою і дофарбовують спиртово-водним розчином фуксину (Пфейфера) або 1% водним розчином нейтрального червоного протягом часу від 1 хв. до 2 хв. Фарбу зливають, мазок промивають водопровідною водою, висушують на повітрі або фільтрувальним папером і мікроскопують.

Додаток В

(обов’язковий)

УСТАТКОВАННЯ, ЗАСОБИ ТА МАТЕРІАЛИ

В.1 Перелік устатковання для проведення мікробіологічних досліджень:

  • автоклав вертикальний, що забезпечує температуру від 105 оС до 135 оС і тиск до 2 атм. згідно з чинними нормативними документами;
  • автоклав вертикальний згідно з чинними нормативними документами;
  • іономір універсальний ЭВ-74 або потенціометр універсальний рН-340 згідно з чинними нормативними документами з похибкою не більше ніж ±0,05;
  • ваги лабораторні І або ІІ класу точності згідно з ГОСТ 24104 з найбільшою межею зважування 200 г і допустимою похибкою ±2 мг для зважування реактивів;
  • ваги лабораторні ІІІ класу точності згідно з ГОСТ 24104 з найбільшою межею зважування 1000 г і допустимою похибкою ±10 мг;
  • термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру від 28 оС до 55 оС з точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
  • холодильник електричний побутовий згідно з ГОСТ 16317-76;
  • мікроскоп марки «Биолам Д-11» згідно з ГОСТ 8074 або аналогічний;
  • мікроскоп світловий біологічний зі збільшенням у (900-1000)х разів згідно з чинними нормативними документами;
  • мікроскоп люмінесцентний зі збільшенням 63х-1500х згідно з чинними нормативними документами;
  • прилад для підрахування колоній бактерій зі збільшувальним склом х3 згідно з чинними нормативними документами;
  • стерилізатор паровий медичний з режимами стерилізації від температури 100 оС (текучою парою) до 126 оС (під тиском) згідно з ГОСТ 19569 або аналогічний;
  • дистилятор згідно з чинними нормативними документами, що забезпечує якість дистильованої води згідно з ГОСТ 6709, або прилад для отримання води аналітичної якості;
  • шафа сушильна стерилізаційна, яка забезпечує температуру від 100 оС до 200 оС згідно з чинними нормативними документами;
  • магнітні мішалки з підігрівом до 30 оС для приготування середовищ згідно з чинними нормативними документами;
  • прилад для струшування (шейкер), з амплітудою коливання від 3 мм до 4 мм і частотою від 4 Гц до 6 Гц за температури від 16 оС до 25 оС, або з коловим типом струшування, що має частоту обертів (200-1200) об/хв. та діаметр орбіти струшування у межах 3 мм, згідно з чинними нормативними документами;
  • прилад для вимірювання оптичної щільності розчину (оптичний стандарт каламутності) на 10 од. з діапазоном вимірювання МакФарланда від 0 McF до 10 McF і довжиною хвилі (535 ± 20) нм згідно з чинними нормативними документами.

В.2 Перелік матеріалів та засобів для проведення мікробіологічних досліджень:

  • баня водяна з терморегулятором, яка дозволяє підтримувати температуру від 20 оС до 100 оС з відхилом ± 1 оС від заданої температури;
  • дозатори для розливу поживних середовищ з регулюванням точності об’єму дози в 1 % згідно з чинними нормативними документами;
  • термометри рідинні скляні з діапазоном температури від мінус 50 оС до 50 оС згідно з ГОСТ 28498 з межею допустимої похибки ±0,5 оС і ціною поділки шкали 0,5 оС;
  • лупа зі збільшенням у (5-10) разів згідно з ГОСТ 25706;
  • спиртівки лабораторні скляні згідно з ГОСТ 25336;
  • годинник механічний з сигнальним пристроєм згідно з ГОСТ 3145.
  • скельця предметні згідно з ГОСТ 9284;
  • скельця покривні згідно з ГОСТ 6672;
  • петлі бактеріологічні № 0, № 1, № 2 згідно з чинними нормативними документами;
  • пінцети медичні згідно з ГОСТ 21241;
  • скальпель медичний згідно з ГОСТ 21240;
  • ножиці медичні згідно з ГОСТ 21239;
  • штативи для пробірок (металеві) згідно з чинними нормативними документами;
  • чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
  • ступки фарфорові з товкачиком згідно з ГОСТ 29225;
  • палички скляні згідно з ГОСТ 25336;
  • палички скляні згідно з чинними нормативними документами;
  • піпетки згідно з ГОСТ 29169;
  • піпетки згідно з ГОСТ 29227;
  • піпетки згідно з ГОСТ 29228;
  • пробірки скляні бактеріологічні (біологічні) П2-10-90 ХС; П3-5ХС, тощо згідно з ГОСТ 25336;
  • стакани місткістю 100 см3, 250 см3, 500 см3, 1000 см3 згідно з ГОСТ 25336;
  • колби місткістю 100 см3, 250 см3, 500 см3, 1000 см3 згідно з ГОСТ 25336;
  • колби конічні місткістю 40 см3, 200 см3, 400 см3, 1000 см3 та 1600 см3 згідно з ГОСТ 19908;
  • колби мірні згідно з ГОСТ 1770;
  • циліндри мірні згідно з ГОСТ 1770;
  • лійки В-36-80ХС; ВФ-1-75ХС згідно з ГОСТ 25336 або ГОСТ 19908;
  • марля медична згідно з ГОСТ 9412;
  • марля побутова згідно з ГОСТ 11109;
  • вата медична гігроскопічна згідно з ГОСТ 5556;
  • папір фільтрувальний лабораторний згідно з ГОСТ 12026;
  • поплавки (трубки Дархема) згідно з чинними нормативними документами;
  • олівці по склу (склографи) згідно з чинними нормативними документами;
  • папір індикаторний універсальний згідно з чинними нормативними документами.

В.3 Замість зазначених у цьому стандарті дозволено використовувати аналогічні засоби вимірювальної техніки, випробувальне та допоміжне устатковання, які за своїми метрологічними та технічними характеристиками задовольняють вимоги цього стандарту.

Додаток Г

(рекомендований)

 АЛЬТЕРНАТИВНІ ТА ШВИДКІ МЕТОДИ

Г.1 Для альтернативних і швидких методів, призначених для попереднього встановлення діагнозу на сальмонельоз, використовують тест-системи вітчизняного чи закордонного виробництва, які стандартизовані та зареєстровані в Україні, згідно з нормативним документом від виробника.

Г.2 Матеріали та реактиви для швидких та альтернативних методів аналізу готують за прописом виробника.

Г.3 Використання хромогенних та флюорогенних поживних середовищ

Використовують хромогенні та флюорогенні поживні середовища для визначання бактерій роду Salmonella.

Сутність дії хромогенних та флюорогенних поживних середовищ основана на виявленні високоспецифічних ферментів у мікроорганізмів, які визначаються.

У склад середовища входить хромогенний субстрат – речовина, під час розщеплення якої ферментами, специфічними для певного виду мікроорганізмів, утворюються продукти, які мають забарвлення і/або флуоресценцію, внаслідок чого колонії мікроорганізмів забарвлюються у певний колір або набувають здатності до флуоресценції під час ультрафіолетового опромінення.

Хромогенний субстрат або суміш субстратів вводять до складу поживних середовищ, у тому числі і до селективних для первинного посіву. Виділення чистої культури та її ідентифікування можливі вже протягом першої доби дослідження. Іноді треба використовувати підтверджувальні тести. У цьому випадку використовують нову характеристику бактерій роду Salmonella – утворення кислоти з пропіленгліколю. Бактерії роду Salmonella утворюють кислоту з пропіленгліколю і тому формують червоні колонії. Інші кишкові грамнегативні бактерії – безбарвні.

Г.4 Використання хромогенного РАМБАХ-агару

Г.4.1 Суть методу

Поживні речовини РАМБАХ-агару забезпечують швидкий ріст ентеробактерій. Дезоксихолат натрію інгібує супутню грампозитивну мікрофлору. Бактерії роду Salmonella продукують кислоту з пропіленгліколю, внаслідок чого відбувається зміна рН-середовища, і колонії Salmonella забарвлюються у червоний колір. Для диференціювання бактерій роду Salmonella від коліформних бактерій до складу середовища введено хромогенну суміш, яка виявляє наявність ферменту β–галактозидази – характерного ферменту коліформних бактерій. Коліформні бактерії ростуть у вигляді синьо-зелених або синьо-фіолетових колоній. Решта ентеробактерій і грамнегативні бактерії, такі як Proteus, Pseudomonas, Shigella виростають у вигляді безбарвних чи жовтуватих колоній. РАМБАХ-агар забезпечує однозначне диференціювання бактерій роду Salmonella від інших бактерій.

Підготовлені чашки Петрі із середовищем опалесціюють і мають злегка рожевий колір. Перед посівом чашки треба підсушити.

Г.4.2 Проведення дослідження

Суспензії досліджуваного матеріалу висівають на поверхню хромогенного агару бактеріологічною петлею. Інкубують в аеробних умовах від 24 год. до 48 год. за температури від 35 оС до 37 оС.

Г.4.3 Оцінювання результатів

Бактерії роду Salmonella утворюють на поверхні поживного середовища колонії червоного кольору, коліформи – синього або синьо-фіолетового, інші ентеробактерії – безбарвні або жовтуваті.

Г.5 Серотипування Salmonella методом латексної аглютинації

Використовують тест-системи для бактерій роду Salmonella (Salmonella typhimurium та Salmonella enteritidis).

Сутність методу. Тест-система призначена для швидкого серологічного аналізу бактерій роду Salmonella в культуральних бульйонах та з виділених чистих культур методом латексної аглютинації, з метою визначення їхньої приналежності до основних серологічних груп.

В основі дії тест-системи лежить взаємодія специфічних антитіл бактерій роду Salmonella груп А, В, С, D, Е, нанесених на латексні часточки, та антигеном сальмонел, які знаходяться у бульйоні чи суспензії.

До комплекту тест-системи входять імунореагенти, які представляють собою суміші латексних суспензій червоного, блакитного та зеленого кольору. Кожна латексна суспензія сенсибілізована антитілами до певної групи бактерій роду Salmonella. У ході аналізу кольорові латексні часточки утворюють агрегати зі специфічними антигенами бактерій роду Salmonella, що призводить до зміни кольору. Цей метод оснований на візуальному визначанні наявності конгломератів аглютинації, колір яких відповідає конкретній серологічній групі бактерій роду Salmonella.

Тривалість аналізу – 4 хв. Аналіз використовують як додатковий підтверджувальний тест у комбінації з імуноферментним методом, а також класичними методами.

Проведення та облік результатів досліджень – згідно з інструкцією виробника, яка додається до тест-системи.

Г.6 Імунохроматографічний експрес-тест

Використовують імунохроматографічні експрес-тести для виявлення бактерій роду Salmonella.

Сутність методу. Імунохроматографічні експрес-тести призначені для виявлення (індикації) бактерій роду Salmonella, Listeria, E.coli 0157. Вони представляють собою діагностичну тест-панель з лункою для внесення зразка і вікном з тестовою та контрольною зонами.

Принцип дії експрес-тестів оснований на методі візуальної імунохроматографії – різновиду імуноферментного аналізу. Антигени досліджуваних бактерій, які є у дослідному зразку, взаємодіють з міченими золотом антитілами з утворенням комплексу антиген-антитіло. Під час проходження по підкладці тесту комплекс антиген-антитіло зв’язується з імобілізованими антитілами з утворенням червоних ліній у тестовій і контрольних зонах.

Досліджують попередньо збагачені зразки.

Проведення та облік результатів досліджень – згідно з інструкцією виробника, яка додається до експрес-тестів.

Г.7 Метод гібридизаційного ДНК-РНК аналізу

Використовують прилад «Люмипроб-24» або аналогічний. Метод основано на твердофазному гетерогенному гібридизаційному ДНК-РНК аналізі з хемілюмінесцентним детектуванням.

Сутність методу. Метод гетерогенного твердофазного гібридизаційного аналізу нуклеїнових кислот засновано на принципі гібридизації ділянки бактеріального геному із закріпленими на твердофазному носії (стінки пробірки) комплементарним до визначеної послідовності ДНК олігонуклеотидним зондом, міченим флуоресцентним барвником, і подальшій детекції гібридів за ступенем їхньої хемілюмінесценції у приладі-люмінометрі.

Метод виконується у форматі тест-систем (наборів).

Метод передбачає висівання певної кількості досліджуваного зразка у спеціальні неселективні і селективні середовища, інкубування посівів для накопичення мікроорганізмів, оброблення культуральної рідини лізуючим буфером для денатурації бактеріальної рибосомальної РНК, гібридизацію фрагментів денатурованої РНК з комплементарним їй міченим зондом, який входить до набору «Люмипроб-24 Salmonella», хемілюмінесцентним детектуванням продуктів реакції.

Проведення та облік результатів досліджень – згідно з інструкцією виробника, яка додається до експрес-тестів.

 

Додаток Д

(довідковий)

БІБЛІОГРАФІЯ

1 Manual of diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals, charter 2.3.11; 2.9.9 (Керівництво з стандартів для діагностичних тестів та вакцин для наземних тварин», МЕБ, 2009

2 Настанова з бактеріологічної діагностики сальмонельозів тварин, затверджена наказом Головного державного інспектора ветеринарної медицини України від 08.05.2002 р. за № 15-14/134

3 Правила відбору зразків патологічного матеріалу, крові, кормів, води та пересилання їх для лабораторного дослідження, затверджені наказом Голови Державного департаменту ветеринарної медицини Мінсільгосппроду України № 15-143/111 від 15.04.97 р.

4 Методичні вказівки «Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів», затверджені наказом Міністерства охорони здоров'я України 05.04.2007 за № 167

5 ДНАОП 2.1.20-1.03-99 Правила охорони праці в лабораторіях ветеринарної медицини, затверджені наказом Держнаглядохоронпраці 20.04.99 за № 67 та зареєстровані в Міністерстві юстиції України 11.10.99 за № 695/3988

6 Правила техники безопасности, производственной санитарии и санитарно-противоэпидемического режима для предприятий по производству бактериологических и вирусологических препаратов (Правила техніки безпеки, виробничої санітарії та санітарно-протиепідемічного режиму для підприємств по виробництву бактеріологічних і вірусологічних препаратів), затверджені Міністерством охорони здоров’я СРСР 10.09.1979 р.

7 Правила безопасности, производственной санитарии, охранно-карантинного и ветеринарно-санитарного режимов на предприятиях биологической промышленности (Правила безпеки, виробничої санітарії, охоронно-карантинного і ветеринарно-санітарного режимів на підприємствах біологічної промисловості), затверджені Головним управлінням ветеринарії Держагропрому СРСР 14.08.89

8 ДСН 3.3.6.042-99 Державні санітарні норми мікроклімату виробничих приміщень, затверджені Постановою Головного державного санітарного лікаря України від 01.12.1999 р., № 42

9 ДСН 3.3.6.037-99 Державні санітарні норми виробничого шуму, ультразвуку та інфразвуку, затверджені Постановою Головного державного санітарного Лікаря України від 01.12.1999 р., № 37

10 СанПин № 4630-88 Санитарные правила и нормы по охране поверхностных вод от загрязнения (Санітарні правила і норми з охорони поверхневих вод від забруднень), затверджені Міністерством охорони здоров’я СРСР 04.07.88, № 4630

11 ДСП 201-97 Державні санітарні правила охорони атмосферного повітря населених місць (від забруднення хімічними та біологічними речовинами), затверджені Міністерством охорони здоров’я України 09.07.97 за № 201

12 СанПин 42-128-4690-88 Санитарные правила и нормы содержания территорий населенных мест (Санітарні правила і норми утримування територій населених міст), затверджені Міністерством охорони здоров’я СРСР від 05.08.88 р., № 4690

 Код за УКНД

 Ключові слова: бактеріологічний метод, біохімічні властивості, мікроскопічний метод, культури, сальмонельоз, середовище, серологічний метод, Salmonella

 

 

 

 

Pages: 1 2 3 4 5 6

Залишити відповідь

Ваша e-mail адреса не оприлюднюватиметься. Обов’язкові поля позначені *

:wink: :twisted: :roll: :oops: :mrgreen: :lol: :idea: :evil: :cry: :arrow: :?: :-| :-x :-o :-P :-D :-? :) :( :!: 8-O 8)