Домашня птиця 2017 - акція      
   Продамо підрощених курочок    
   Стан птахівництва у 2016 році   


⇑ На початок ⇑

Dutch English French Italian Polish Russian Turkish Ukrainian

Імуномоніторинг метапневмовірусної інфекції птиці

Вивчено розповсюдження нового інфекційного захворювання птиці (метапневмовірусної інфекції) серед індиків та курей в птахогосподарствах України, розроблено вітчизняні РНГА- та ІФА-діагностикуми, за допомогою яких було проведено епізоотологічний моніторинг у птахівничих господарствах щодо розповсюдження даної інфекції. Встановлено, що дані методи можна використовувати в практиці ветеринарної медицини для контролю МПВ інфекції.metapnevmovirusКлючові слова: метапневмовірусна інфекція, індики, кури, РНГА, ІФА.

Sammary.Studied the propagation of a new infectious disease of poultry (metapneumovirus infection) of turkeys and chickens in poultry farms in Ukraine, developed reaction gemagglytination indirect ELISA and diagnostic tools, using by which was held ehpizootologic monitoring poultry farms on the spread of the infection. Found that these methods can be used in the practice of veterinary medicine for the control infections metapneumovirus.

Key words: metapneumovirus,infection, turkeys, chichens, indirect gemagglytination reaction, ELISA.

 Вступ. За останні 5 років (2009-2013) постачання з-за кордону продукції птахівництва в Україну призвело до розповсюдження нових інфекційних захворювань, до яких відноситься і метапневмовірусна (пневмовірусна) інфекція птиці. Захворювання уражає верхні та нижні дихальні шляхи індиків та курей. Причиною хвороби є пневмовірус (APV), який відноситься до роду Metapneumovirus.

Метапневмовірусна інфекція (МПВІ) зустрічається в країнах з розвинутим птахівництвом (Ізраїль, США, Канада, Англія, Північна Ірландія, Бразилія, Марокко, Росія).

Щодо розповсюдження МПВІ в Україні, такі дослідження не проводились. Напруженість імунітету у щепленої птиці до метапневмовірусу спеціалістами господарств не контролювалися у зв’язку з відсутністю в нашій країні діагностичних препаратів.

Для визначення розповсюдження МПВІ та оцінити напруженості імунітету після щеплення птиці за кордоном використовують такі методи як: РНІФ, РН, ІФА та метод імуноцитохімії.

На озброєнні науково-дослідних та виробничих ветеринарних лабораторій в Україні відсутні стандартні вітчизняні діагностичні набори для експрес – діагностики MПВI (TRT-інфекції) птиці.

За період 2009-2011 році в Інституті птахівництва НААН був розроблений набір компонентів для визначення специфічних антитіл до збудника МПВI на основі реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) та проводяться дослідження щодо розробки вітчизняної ІФА- тест-системи.

Метою було визначити діагностичну цінність еритроцитарного антигену на основі РНГА, розробленого в ІП НААН, у порівнянні з ІФА-діагностикумом фірми «BioChek» (Нідерланди) та розробити вітчизняну ІФА-тест-систему для контролю МПВІ птиці.

Матеріали і методи. Приготування формалінізованих та танізованих еритроцитів проводили за загальноприйнятою методикою [1].

Еритроцитарний діагностикум для РНГА складається з формалінізованих та сенсибілізованих еритроцитів барана, гіперімунної сироватки крові з титром не нижче 1:32 і нормальної сироватки крові курей.

Антигеном для сенсибілізації еритроцитів була екстраембріональна вірусутримуюча рідина з інфекційним титром вірусу 10-2,9ЛД50/см3, яку отримували шляхом інфікування 10-денних СПФ-ембріонів курей, або інтактних 12-денних ембріонів індиків [7].

Діагностичну цінність еритроцитарного антигену на основі РНГА встановлювали у порівнянні з ІФА-методом (діагностичний набір ART ELISA СК120 серія № FS5135 фірми «BioChek» (Нідерланди).

Накопичення метапневмовірусу для ІФА-методу буде здійснюватися шляхом його репродукції на перещеплюваній культурі клітин Vero або на первинно-трипсинізованій культурі клітин курячих СПФ-ембріонів (ФЕК).

Для ІФА-діагностикуму напрацьований антиген очищали та концентрували за розробленою нами схемою, яка включала підготовчий етап, попереднє очищення вірусу, концентрування вірусу та завершальне очищення вірусу.

Діагностичні сироватки крові (гіперімунну) отримували шляхом гіперімунізації 30-денних курчат за розробленою нами схемою (отримано патент). Нормальну сироватку одержували з крові інтактних курчат віком 90 діб методом тотального знекровлення. Гіперимунну та нормальну сироватки крові зберігали у замороженому (за температури мінус 20 оС) або ліофілізованому стані. Сенсибілізація планшетів, внесення досліджуваних сироваток на планшети та антивидового кон’югату проводилися за загально-прийнятими методами [4, 7, 8].

Результати досліджень. Серологічні дослідження щодо МПВІ проводили двома діагностичними методами –РНГА та ІФА в птахівничих господарствах Донецької, Харківської, Житомирської та Чернівецької областях. Кров відбирали як у щепленої, так і не щепленої проти метапневмовірусної інфекції птиці.

Всього було досліджено 211 проб сироваток крові. Від індиків кросу «Біг-6» віком 4, 22-43 діб птахогосподарств Донецької та Чернівецької обл. та породи біла широкогруда «Харківський-56» віком 74 доби Харківської обл. – 168 проб; від курей породи бірківська барвиста з птахогосподарства Харківської обл., та кросу «Хайсекс коричневий» віком 170-180 діб, Житомирської обл. – 54 проби.

Згідно результатів серологічних досліджень щодо МПВІ були виявлені подібні титри антитіл як при використанні РНГА, так і ІФА-методу.

Так, у індичат віком 4 доби двома діагностикумами були виявлені материнські антитіла до МПВI у достатньо високих титрах, які складали в РНГА 1:128 -1:256 (7 — 8 log2) і в ІФА 3776-14404.

Вже на 22-25 добу у них були виявлені вірогідно низькі титри антитіл як в РНГА 2-3 log2, так і в ІФА – 68-594 (нижче діагностичного –1650).

Аналогічні результати були отримані при проведенні імуномоніторингу серед індиків кросу «Біг-6» віком 43 доби у птахогосподарстві Чернівецької області. На фоні щеплення у клінічно хворої птиці були виявлені специфічні до МПВ антитіла, які сягали розведень 7-9 log2 в РНГА та 4865-27869 в ІФА.

У курей породи бірківська барвиста віком 170 діб (Харківської обл.) при інапарантній формі перебігу інфекції специфічні антитіла були виявлені у титрах 5-8 log2 (РНГА) і 4997-10414 (ІФА).

Також обома тестами встановлено розбіжність у титрах антитіл від 2 до 7 log2 (РНГА) і від 0 до 9547 (ІФА), що склало 45 – 36 %, відповідно, у індиків білої широкогрудої породи (Харківська обл.) щодо МПВІ. Незважаючи на те, що середньоарифметичний титр до МПВ у індиків виявився нижче діагностичного (1298+192), отримані показники можуть свідчити про циркуляцію польового вірусу у господарстві.

Таким чином, серологічними дослідженнями як в РНГА, так і ІФА у дослідженої птиці були визначені антитіла до метапневмовірусу (МПВ) від 36 до 100 % випадків.

Відсутність специфічних антитіл або виявлення їх нижче діагностичних – 1-2 log2 (РНГА) і 87-958 (ІФА) були виявлені у курей кросу «Хайсекс коричневий» (Житомирська обл.) та у індиків віком 25-30 діб (Чернівецька обл.).

Якщо врахувати, що вартість розробленого нами РНГА- діагностикуму для контролю МПВІ птиці (індиків, курей та бройлерів) дорівнює 0,07 грн за 1 зразок сироватки крові, а ІФА-метод фірми «BioChec» – 8,9 грн за 1 зразок, то це майже, у 120 разів економічно дешевше, ніж при використанні імпортної тест-системи ІФА.

Враховуючи відсутність у ветеринарній практиці лабораторних методів діагностики для контролю метапневмовірусної інфекції птиці, було розроблено методичні рекомендації: «Серологічна діагностика пневмовірусної інфекції птиці за допомогою реакції непрямої гемаглютинації (РНГА)».

Крім РНГА-методу діагностики нами ведеться розробка вітчизняного ІФА-діагностикуму. Для підбору оптимального робочого розведення сироватки та виведення формули з метою визначення титрів антитіл в одному розведенні досліджено 100 проб польових сироваток крові курей з різним рівнем антитіл до метапенвмовірусу. Рівень антитіл визначали методом непрямого ІФА послідовними розведеннями сироватки від 1:100 до 1:12800.

При відпрацюванні оптимальних співвідношень компонентів (антигену та кон’югату) для виготовлення ІФА-діагностикуму визначено їх робочі розведення методом «шахового титрування»:

  • антигену, який наносили на планшет –1:500
  • антивидового імунопероксидазного кон’югату проти Іg G курей –1:4000.

Для визначення оптимального розведення сироваток та виведення формули обрахунків титрів антитіл методом одного розведення проводили математичний аналіз отриманих результатів. Визначали значення S|P (відношення оптичної щільності досліджуваної сироватки до оптичної щільності позитивного контролю, з відніманням оптичного показника негативного контролю): S\P100, S\P200, S\P400, S\P800 – в розведеннях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 (результати оброблялися з використанням комп’ютерної програми Microsoft Exсel) .

Для кожного розведення визначали коефіцієнт кореляції з значенням титрів, отриманих методом послідовних розведень ( значення lg T до lg S/P). Коефіцієнт кореляції складав для розведень: 1:100 -– 90,59 % ; 1:200 – 92,00 %; 1:400 – 92,16 % ; 1: 800 – 88,90 %

Розведення сироватки 1:400 мало найвищий коефіцієнт кореляції, і було взято за робоче.

У відповідності з значеннями оптичних густин досліджуваних сироваток, за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Exсel, була побудована калібрувальна крива й виведено рівняння лінійної регресії для обрахунку логарифмічного значення титрів антитіл у сироватках (рис)

Рис. Калібрувальна крива значення lg T до lg S/P

Обраховано формулу титрів антитіл у сироватках крові курчат при тестуванні їх в одному розведенні: Lg T = 3,7981 + 0,8524 * lg (S/P400), що спрощує проведення аналізу. Завдяки розробленій тест-системі ІФА для визначення антитіл до МПВ можна проводити епізоотологічний моніторинг даного захворювання та контроль поствакцинального імунітету. Реакція є кількісною, простою у використанні.

В порівнянні з закордонними аналогами вітчизняний ІФА-діагностикум буде дешевшим у 4 рази.

Висновок.

1. За допомогою розробленого у Інституті птахівництва НААН набору для діагностики метапневмовірусної інфекції на основі РНГА у порівнянні з ІФА-методом фірми «BioChec» (Нідерланди) проведено епізоотологічний моніторинг у птахівничих господарствах на різних видах птиці. Отримані результати свідчать про діагностичну цінність набору. Розроблений РНГА- метод може успішно використовуватися фахівцями ветеринарної медицини для контролю метапневмовірусної інфекції на рівні з ІФА.

2. Розроблено технологічні параметри вітчизняної тест-системи ІФА для контролю МПВІ.

Список літератури

1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическаим и вирусологическим методам исследования. – М.:Медицина, 1982.- С.129-140

2. Борисова И.А., Старов С.К. Пневмовирусная инфекция птиц //Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2006. – Т.4. – С. 281-296

3. Волкова М.А., Батченко Г.В., Мудрак Н.С. Непрямой вариант иммуноферментного метода для определения антител к пневмовирусу птиц // Актуальн. пробл. инфекц. патологии жив-х: матер. Междунар. науч. конф., посвящен. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2003. – С. 358-361

4. Ирза В.Н., Оковытая Т.В., Борисов В.В. Серологический мониторинг по птичьему пневмовирусу (Avian Pneumovirus — APV) в России // Конференция по птицеводству. –Зеленоград, 2003. – С. 222-223

5. Методические рекомендации по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы с использованием серологических реакций. Ч.1: методические рекомендации /ФГУ «ВНИИЗЖ», 2008. – С. 59-60.

6. Наливайко Л.І., Ніколаєнко Ю.Ю., Бондаренко А.Л., Рябека Д.А. Епізоотологічне обстеження птахівничих господарств України щодо метапневмовирусної інфекції // Ветеринарна медицина України. –№ 1. – 2011. – С.9-11.

7. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах // Ветеринарная вирусология, –М. «Колос». –1984. – С.11.


 

1. Birger M.O. Spravochnik po mikrobiologicheskaim i virusologicheskim metodam issledovaniya. – M.:Meditsina, 1982.- S.129-140

2. Borisova I.A., Starov S.K. Pnevmovirusnaya infektsiya ptits //Tr. Federalnogo tsentra okhrany zdorovya zhivotnykh. – Vladimir, 2006. – T.4. – S. 281-296

3. Volkova M.A., Batchenko G.V., Mudrak N.S. Nepryamoy variant immunofermentnogo metoda dlya opredeleniya antitel k pnevmovirusu ptits // Aktualn. probl. infekts. patologii zhiv-kh: mater. Mezhdunar. nauch. konf., posvyashchen. 45-letiyu FGU «VNIIZZh». – Vladimir, 2003. – S. 358-361

4. Irza V.N., Okovytaya T.V., Borisov V.V. Serologicheskiy monitoring po ptichyemu pnevmovirusu (Avian Pneumovirus — APV) v Rossii // Konferentsiya po ptitsevodstvu. –Zelenograd, 2003. – S. 222-223

5. Metodicheskiye rekomendatsii po diagnostike zabolevaniy selskokhozyaystvennykh zhivotnykh i ptitsy s ispolzovaniyem serologicheskikh reaktsiy. Ch.1: metodicheskiye rekomendatsii /FGU «VNIIZZh», 2008. – S. 59-60.

6. Nalivayko L.І., Nіkolaєnko Yu.Yu., Bondarenko A.L., Ryabeka D.A. Yepіzootologіchne obstezhennya ptakhіvnichikh gospodarstv Ukraїni shchodo metapnevmovirusnoї іnfektsії // Veterinarna meditsina Ukraїni. –№ 1. – 2011. – S.9-11.

7. Syurin V.N., Belousova R.V., Fomina N.V. Kultivirovaniye virusov v kurinykh embrionakh // Veterinarnaya virusologiya, –M. «Kolos». –1984. – S.11.

8. Baxter-Jones C. J., Cook A., Frazier M. Close relationship between TRT virus isolates. //Vet. Rec. –1987. –120:562.

9. Chettle N. J., Wyeth P.J. The use of an ELISA test to detect antibodies to turkey rinotracheestis // Br. Vet. J. – 1988. – 144:282-287.


 

УДК 619:616-07:576.85 ж. птахівництво ДДСП НААН

 Державна дослідна станція з птахівництва НААН України

Л.І. НАЛИВАЙКО, доктор ветеринарних наук

О.В.ЦИНОВИЙ, кандидат біологічних наук,

О.А.ШОМІН, науковий співробітник

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

:wink: :twisted: :roll: :oops: :mrgreen: :lol: :idea: :evil: :cry: :arrow: :?: :-| :-x :-o :-P :-D :-? :) :( :!: 8-O 8)


Оголошення


Розробки для птахівництва



Архів матеріалів
Октябрь 2017
Пн Вт Ср Чт Пт Сб Вс
« Авг    
 1
2345678
9101112131415
16171819202122
23242526272829
3031