Ukrainian Dutch English French Italian Polish Russian Turkish
Птахівництво України і cвіту | менеджмент, аналітика, реформи, стандарти


Птиця сільськогосподарська. Методи лабораторної діагностики колібактеріозу

5  Методи лабораторної діагностики

5.1  Прижиттєва діагностика

5.1.1 Для прижиттєвої діагностики колібактеріозу використовують послід від хворої птиці та/або клоачні змиви.

5.1.2 Засоби та допоміжні пристрої

  •  фізіологічний розчин згідно з нормативним документом від виробника або згідно з А.3 Додатку А цього стандарту;
  •  середовище Ендо або Левіна згідно з А.24 Додатку А цього стандарту;
  •  агар  Хоттінгера згідно з А.24 Додатку А цього стандарту;
  •  спирт етиловий згідно з  ДСТУ 4221;
  •  набір сироваток ешерихіозних антиадгезивних аглютинуючих згідно з нормативним документом від виробника;
  •  скельця предметні згідно з ГОСТ 6672;
  •  піпетки згідно з  ГОСТ 29227;
  •  пробірки згідно з ГОСТ 25336;
  •  петля бактеріологічна  згідно з чинними нормативними документами.

5.1.3  Правила готування до досліджування

5.1.3.1  До проб відібраного посліду (у кількості  не більше ніж 0,5 г) або у  пробірки з тампонами з  клоачними  змивами додають 10 см3 стерильного 0,85 % розчину хлориду натрію (фізіологічний розчин), ретельно розмішують і витримують від 10 хв до 15 хв за кімнатної температури (від 18 оС до 20 оС), щоб осадити крупні частинки. Надосадову рідину використовують для посіву на поживні середовища не пізніше ніж через (1-2) год після приготування.

5.1.3.2 Перед посівом матеріалу на середовища Ендо чи Левіна поверхню середовищ зрошують (1-2) см3 етилового спирту-ректифікату (96 %) для затримання росту протею. Спирт, який не поглинувся середовищем,  відсмоктують  пастерівською піпеткою, нахиляючи чашку Петрі. Потім середовище підсушують у термостаті протягом  (10-15) хв. за температури (25-37) оС, поки не зникнуть вологі крапельки з поверхні середовища.

5.1.3.3 Антиадгезивні сироватки готують  у розведенні 1:10. Для цього з кожного флакону із набору  стерильною піпеткою відбирають по 1,0 см3 сироватки і переносять у стерильні пробірки з 0,9 см3 стерильного фізіологічного розчину. Розведені сироватки можна зберігати у пробірках, закритих гумовими корками, за температури від 4 оС до 10 оС протягом трьох місяців.

5.1.4 Методика та правила проведення досліджування

Кожну підготовлену пробу посліду (надосадову рідину) або змивів з клоаки висівають на поверхню середовища Ендо  (Левіна) пастерівською піпеткою, ретельно розтираючи зігнутим кінцем піпетки, або використовують бактеріологічну петлю, якою матеріал висівають на поверхню середовища частими короткими штрихами. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±0,5) оС протягом 24 год.і вивчають їхні морфологічні, культуральні та ферментативні властивості. Колонії (від п’яти до десяти колоній) з типовими  для E.coli ознаками пересівають бактеріологічною петлею на агар Хоттінгера та витримують у термостаті за температури (37±0,5) оС протягом 24 год.

Вирощені культури E.coli  досліджують у крапельній реакції аглютинації.

На знежирене предметне скло пастерівською піпеткою наносять краплину комплексної антиадгезивної сироватки у робочому розведенні. До неї бактеріологічною петлею додають досліджувану культуру, змішують.  Реакцію враховують протягом 1 хв. за кімнатної температури (від 18 оС до 20 оС). Контролем служить досліджувана культура з краплею  фізіологічного розчину,  рН якого повинен бути у межах від 7,2 до 7, 4 для запобігання самоаглютинації.  У разі позитивної реакції аглютинація  проявляється склеюванням мікробних клітин у пластівці або зерна однакового розміру з повним або частковим просвітленням рідини. У контролі аглютинацію не спостерігають.

Культури E.coli, що дали позитивну реакцію з комплексною антиадгезивною сироваткою, досліджують з іншими сироватками, які входять до набору.

5.1.5   Опрацювання результатів

Культури E.coli, що дали позитивну реакцію з однією з антиадгезивних сироваток з набору, відносять до збудників колібактеріозу.

5.2 Бактеріологічний метод

Суть методу полягає в ізоляції та ідентифікації E.coli – збудника хвороби  колібактеріозу.

5.2.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  м’ясо-пептонний бульйон (далі – МПБ)  згідно з ГОСТ 20730 або згідно з А.4 Додатку А цього стандарту;
  •  м’ясо-пептонний агар (далі – МПА) згідно з А.5 Додатку А цього стандарту;
  •  середовище Ендо згідно з А.24 Додатку А цього стандарту;
  •  середовище Левіна згідно з А.6 Додатку А цього стандарту;
  •  середовище Кесслера  згідно з А.7 Додатку А цього стандарту;
  •  бульйон Мак-Конки згідно з А.8 Додатку А цього стандарту;
  •  фізіологічний розчин згідно з нормативним документом від виробника або згідно з А.3 Додатку А цього стандарту;
  •  поживне середовище для виділення і диференціації E.сoli O157: H7 та інших ентеробактерій за ознакою ферментації сорбіту (ЕДКС-агар) згідно з А.24 Додатку А цього стандарту, або  «Сорбитол E. сoli O157:H7 агар» згідно з А.9 Додатку А цього стандарту;
  •  термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним  терморегулятором, що  забезпечує температуру до 55 оС з точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
  •  піпетка пастерівська  згідно з ГОСТ 29227;
  •  скельця предметні згідно з ГОСТ 6672;
  •  спирт етиловий згідно з  ДСТУ 4221;
  •  масло імерсійне кедрове згідно з чинними нормативними документами;
  •  мікроскоп марки «Биолам Д-11» або аналогічний згідно з  ГОСТ 8074.

Дозволено використовувати інші поживні стандартизовані (зареєстровані) середовища, діагностичні матеріали, реактиви, призначені для виконання описаного методу.

5.2.2 Правила готування до досліджування

5.2.2.1 Первинні посіви з патологічного і клінічного матеріалу здійснюють у кімнаті, де проводять розтин, на окремому столі в умовах, які виключають розсіювання мікробів у зовнішнє середовище з дотриманням правил асептики.

5.2.2.2 Досліджувані органи обпалюють шпателем (лопаточкою), розжареним над полум’ям лабораторної спиртівки, і проколюють у місці обпалювання стерильною пастерівською піпеткою, якою відбирають кров з серця і легень. Для кожного органу використовують окрему пастерівську піпетку.

Зіскреби  зі слизової оболонки сліпих відростків кишечнику або зрізи трубчастої кістки у кількості від 0,3 г до 0,5 г від кожної птиці кладуть в окремі пробірки, куди додають по 10 см3 стерильного фізіологічного розчину, добре розмішують скляною стерильною паличкою і витримують від 10 хв до 15 хв за кімнатної температури (від 18 оС до 20 оС), щоб осадити великі шматочки.

5.2.3 Методика та правила проведення досліджування

5.2.3.1 Матеріал висівають на поживні середовища МПБ (або середовище Кесслера, або бульйон Мак-Конки) та МПА (або середовище Ендо, або середовище Левіна), а  також на щільне середовище з сорбітом (сорбітолом) для виявляння E. coli сероварів 0157:Н7 и 0157:Н-. Середовище чутливе до світла, тому всі засіяні чашки захищають від  світла.

Кров з серця, легенів, кістковий мозок наносять на поверхню  середовищ пастерівською  піпеткою і рівномірно розтирають їх скляним шпателем.

Надосадову рідину (суспензію) зі слизової оболонки сліпих відростків кишечнику, зрізу трубчатої кістки висівають на щільні поживні середовища МПА (або середовище Ендо, або середовище Левіна). Для цього  по (2-4) краплі або (0,5-1,0) см3 надосадової рідини розподіляють бактеріологічною петлею або зігнутим кінцем пастерівської піпетки частим штрихом по поверхні середовища.

Перед посівом на тверді середовища (Ендо, Левіна)  поверхню печінки припалюють розжареним шпателем або фламбують.  З печінки роблять відбитки свіжозрізаною частиною органу. Для кожної чашки Петрі з середовищем стерильними ножицями відрізають новий шматочок органу.

Посіви на середовища з сорбітом (сорбітолом) проводять шляхом проведення розрізаної поверхні шматочка органу (з попередньо профламбованої ділянки) по поверхні поживного середовища або відбитків розрізаної поверхні органу. Кров, кістковий мозок, жовч наносять на поверхню середовища пастерівською піпеткою і рівномірно розтирають їх скляним шпателем.

Посіви інкубують у термостаті за температури (37±0,5) оС протягом часу від 18 год  до 24 год.

5.2.4   Опрацювання результатів

Продивляються чашки з культурами, що виросли.

Позитивними вважають посіви:

1) у рідких середовищах:

  •  МПБ – бульйон стає каламутним;
  •  середовище Кесслера – колір середовища змінюється з фіолетового на рожевий з утворенням газу;
  •  бульйон Мак-Конки – колір середовища змінюється з червоного на рожевий з утворенням газу.

2) на щільних диференційно-діагностичних поживних середовищах з’являються колонії – круглі, гладенькі, випуклі або з трохи піднятою у центрі поверхнею, рівними краями, діаметром від 2 мм до 4 мм:

  •  МПА – колонії без кольору з утворенням газу;
  •  середовище Ендо – рожеві, червоні або малинові з металевим блиском або без нього;
  •  середовище Левіна – фіолетові або чорні;
  •  середовище з сорбітом (сорбітолом) – сорбітнегативні ешерихії сероварів  0157:Н7 та 0157:Н-  утворюють прозорі/напівпрозорі колонії сірувато-білого кольору.

5.3 Мікроскопічні дослідження

Для подальших досліджень  відбирають 10 типових для ешерихій колоній (5 колоній, що виросли після посіву посліду або зіскребів зі слизової оболонки сліпих відростків кишечнику і 5 колоній з інших органів  та тканин), а також відбирають із середовища з сорбітом три або чотири колонії, характерних за структурою і кольором для ешерихій сероварів  0157:Н7 та 0157:Н- (маленькі, круглі сіро-білі колонії).

З відібраних колоній готують мазки, фарбують їх за Грамом згідно з Додатком Б цього стандарту.

На пофарбований мазок наносять 1 краплю кедрового масла і проводять мікроскопію під імерсією зі збільшенням (90-100)х.

Якщо на  щільних поживних середовищах ріст типових колоній не реєструють, а у рідких середовищах відзначають характерні ознаки росту ешерихій, готують мазки з них, фарбують за Грамом і досліджують під мікроскопом. У разі виявлення грам-негативних паличок у мазках, культури з МПБ пересівають на чашки зі щільними поживними середовищами (Ендо, Левіна), інкубують у термостаті за температури (37±0,5) оС, переглядають посіви через 24 год. і визначають характер росту бактерій.

Культура E.coli – має вигляд грамнегативної короткої потовщеної палички.

5.4 Реакція на оксидазу

Паралельно з мікроскопічними дослідженнями у кожній з відібраних колоній визначають  реакцію на оксидазу.  E.coli – оксидазонегативна культура.

Оксидазний тест дозволяє диференціювати бактерії родини    Enterobacteriaceae    від    Pseudomonaceae   (останні є    оксидазопозитивними  бактеріями).

5.4.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  реактиви для оксидазного тесту згідно з А.10 Додатку А цього стандарту;
  •  папір фільтрувальний згідно з ГОСТ 12026;
  •  палички  скляні згідно з ГОСТ  25336;
  •  піпетка пастерівська  згідно з ГОСТ 29227.

Дозволено використовувати зареєстровані в Україні комерційні тест-системи для постановки оксидазного тесту (диски на оксидазний тест, системи індикаторних папірців «СИБ-оксидаза» або аналоги) згідно з нормативними документами від виробника.

5.4.2 Методика та правила проведення досліджування

Перший спосіб. Дві чи три ізольовані колонії кожного типу,  які виросли на середовищі Ендо, знімають бактеріологічною петлею чи скляною  паличкою і наносять  штрихами на фільтрувальний папір, змочений одним із реактивів для   оксидазного тесту.

Другий спосіб. Використання оксидазних дисків. Досліджувану колонію/колонії пересівають на похилий поживний агар, інкубують за температури (37 ± 1) °С протягом (18-20) год. Оксидазний диск злегка змочують дистильованою водою і просочують одним з оксидазних реактивів.  Роблять мазок культури на диску і відзначають реакцію не пізніше ніж через 10 сек.

У разі використання комерційних тест-систем процедуру проведення оксидазного тесту виконують згідно з інструкцією, яка додається до тест-системи.

Третій спосіб. Дві або три краплини розчину тетраетил-пара-фенілендіаміну дігідрохлориду (1 % водний розчин) наносять пастерівською піпеткою на поверхню добової агарової культури мікроорганізмів. Реакція протікає протягом 5 хв.

Якщо оксидазний тест проявляється недостатньо чітко, для    підтвердження результату ізольовані колонії можна пересіяти на похилий  поживний  агар і після  підрощування повторити оксидазний  тест.

5.4.3 Опрацювання результатів

Оксидазний тест вважають позитивним (культури E.coli відсутні), якщо:

1) фільтрувальний папір з реактивами для оксидазного тесту або оксидазні диски змінюють забарвлення у місці нанесення бактеріальної маси:

  •  у разі використання гідрохлориду тетраметил-п-фенілендіаміну (А.10 варіант 1) – поява фіолетово-коричневого забарвлення;
  •  у разі використання реактиву (А.10 варіант 2) – поява синього забарвлення.

Реакція відбувається протягом часу від 10 сек (для оксидазних дисків) до двох хвилин (використання фільтрувального паперу).

2)  спостерігають появу рожевого забарвлення, яке переходить поступово у червоне, а потім у чорне – у разі застосування  третього способу.

Оксидазний тест вважають негативним, якщо не відбувається зміна забарвлення.

5.5 Всі колонії, які змінили забарвлення, що вказує на їхню оксидазопозитивність і відсутність культури E.coli, надалі не досліджують. Подальшому дослідженню піддають оксидазонегативні культури E.coli з двох типових колоній, які  пересівають на МПА, МПБ і вирощують у термостаті за температури (37±0,5) оС протягом 24 год, після чого  їх висівають на відповідні поживні середовища для вивчення ферментативних та біохімічних властивостей, у 2 пробірки з МПА для постановки біопроби та готування антигену для серологічної типізації.

5.6 Визначання ферментативних та біохімічних властивостей

5.6.1   Основні характерні відзнаки мікроорганізмів роду Escherichia:

  •  ферментують глюкозу,  лактозу;
  •  утворюють індол;
  •  не утилізують цитрат (відсутність росту на середовищі Сіммонса чи Козера);
  •  не утворюють сірководень.

Додаткові характерні відзнаки мікроорганізмів роду Ecsherichia:

  •   не утворюють ацетоїн  (реакція Фогес-Проскауера);

5.6.2  Ферментація глюкози, лактози

E.coli  ферментує глюкозу, сорбіт, лактозу.

5.6.2.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  середовища  Гісса з глюкозою та лактозою згідно з А.11 Додатку А цього стандарту або вуглеводні напіврідкі середовища з індикатором ВР (водний блакитний + розолова кислота), виготовлені з сухих середовищ   промислового виробництва, згідно з нормативним документом від виробника;
  •  термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним  терморегулятором, що  забезпечує температуру  до 55 оС з точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
  •  пробірки бактеріологічні (біологічні) згідно з ГОСТ 25336.

5.6.2.2 Методика та правила проведення досліджування

Культуру із посівів згідно з 5.5 висівають у середовища  Гісса. Посіви на середовищах з глюкозою інкубують у термостаті за температури (37±0,5) оС протягом 24 год, а на середовищі з лактозою – за температури (43±1) оС  протягом 24 год.

5.6.2.3 Опрацювання результатів

Під час ферментації вуглеводів на середовищах Гісса визначають кислотоутворення  (середовища набувають рожево-червоного кольору у разі використання індикатора Андреде, жовтого кольору – у разі використання індикатора бромтимолового синього) і газоутворення (наявність бульбашок у поплавках на середовищі з глюкозою).

5.6.3  Утворення індолу

E.coli  утворює індол.

5.6.3.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  бульйон  Хоттінгера згідно з А.24 Додатку А цього стандарту;
  •  МПБ з триптофаном згідно з А.12 Додатку А цього стандарту;
  •  індикаторний  папір згідно з А.13  Додатку А цього стандарту;
  •  реактив Ерліха згідно з А.14  Додатку А цього стандарту;
  •  термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним  терморегулятором, що  забезпечує температуру  до 55 оС з точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
  •  пробірки бактеріологічні (біологічні) згідно з ГОСТ 25336.

5.6.3.2 Методика та правила проведення досліджування

Перший спосіб. Культуру E.coli із посівів згідно з 5.5 висівають у пробірку з бульйоном Хоттінгера або МПБ з триптофаном. Під пробку у пробірку поміщають смужку індикаторного паперу, верхній кінець якої притискають ватною пробкою.  Нижній кінець паперу повинен бути на відстані (2-3) см від поверхні середовища. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±0,5) оС протягом 48 год.

Другий спосіб. У пробірку з добовою бульйонною культурою або дводобовою культурою у бульйоні Хоттінгера обережно по стінці додають від п’яти до десяти крапель (0,5 мл) реактиву Ерліха.

5.6.3.3 Опрацювання результатів

Якщо у пробірці накопичується індол, індикаторний папір  змінює жовтий колір на колір від рожевого до інтенсивно малинового. У способі з додаванням   реактиву Ерліха за наявності індолу не пізніше ніж через 5 хв. у прикордонному шарі утворюється яскраво-червоне кільце (реакція позитивна, наявне утворення індолу), жовто-коричневе кільце вказує на негативну реакцію.

5.6.4  Утилізація цитрату

E.coli  не утилізує цитрат.

5.6.4.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  середовище Козера згідно з А.15 Додатку А цього стандарту;
  •  середовище Сіммонса згідно з А.16 Додатку А цього стандарту;
  •  термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним  терморегулятором, що  забезпечує температуру  до 55 оС з точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
  •  пробірки бактеріологічні (біологічні) згідно з ГОСТ 25336.

5.6.4.2 Методика та правила проведення досліджування

Культуру із посівів згідно з 5.5 висівають у пробірки з середовищем Козера або на поверхню середовища Сіммонса. Посіви інкубують за температури (37±0,5) оС протягом часу від 24 год до 48 год.

5.6.4.3 Опрацювання результатів

Якщо оливково-зелений колір середовища залишається без змін, це   свідчить про відсутність росту культури Е.coli на цих середовищах (не утилізують цитрат).

5.6.5 Утворення сірководню

Е.coli не утворює сірководень.

5.6.5.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  середовище Кліглера згідно з А.17 Додатку А цього стандарту;
  •  трицукровий агар згідно з А.18 Додатку А цього стандарту;
  •  термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним  терморегулятором, що  забезпечує температуру  до 55 оС з точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
  •  пробірки бактеріологічні (біологічні) згідно з ГОСТ 25336.

5.6.5.2 Методика та правила проведення досліджування

Культуру із посівів згідно  з 5.5 висівають у середовище  Кліглера або трицукровий агар. Посіви інкубують у термостаті  за температури (37±0,5) оС протягом 24 год.

5.6.5.3 Опрацювання результатів

Почорніння  у стовпчику середовища вказує на утворення сірководню та відсутність Е.coli.

5.6.6  Утворення ацетоїну (реакція Фогес-Проскауера)

E.coli не утворює ацетоїн.

5.6.6.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  середовище Кларка згідно з А.19 Додатку А цього стандарту;
  •  α-нафтол згідно з А.20 Додатку А цього стандарту;
  •  гідроокис калію згідно з  А.21 Додатку А цього стандарту;
  •  термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним  терморегулятором, що  забезпечує температуру  до 55 оС з точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
  •  пробірки бактеріологічні (біологічні) згідно з ГОСТ 25336.

5.6.6.2 Методика та правила проведення досліджування

Культуру із посівів згідно  з 5.5  висівають у пробірки з середовищем Кларка. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±0,5) оС протягом 48 год. Після інкубування посівів до 1 см3 відібраної культуральної рідини додають 0,5 см3 6 % спиртового розчину α-нафтолу і  0,2 см3 розчину гідроокису калію. Після додавання кожного реактиву пробірку струшують. Через (3-5) хв. проводять облік реакції.

5.6.6.3 Опрацювання результатів

У випадку утворення ацетоїну через (15-60) хв. з’являється рожеве забарвлення середовища, що вказує на позитивну реакцію та відсутність E.coli. У разі негативної реакції середовище набуває жовтого кольору, при сумнівній реакції – жовто-помаранчевого.

5.6.7 Розщеплювання сечовини

Бактерії роду E.coli не розщеплюють сечовину.

5.6.7.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  поживне середовище з сечовиною (за Преусом)  згідно з  А.22 Додатку А цього стандарту;
  •  термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з автоматичним  терморегулятором, що  забезпечує температуру  до 55 оС з точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
  • пробірки бактеріологічні (біологічні) згідно з ГОСТ 25336.

5.6.7.2 Методика та правила проведення досліджування

Культури з посівів згідно з 5.5 пересівають штрихом на поверхню середовища з сечовиною. Посіви інкубують за температури  (37±0,5) оС протягом часу від 24 год до 48 год.

5.6.7.3 Опрацювання результатів

У разі відсутності розщеплення сечовини середовище змінює свій колір із зеленкувато-оливкового на жовтий, що є ознакою наявності бактерій роду E.coli. Якщо середовище набуває синього кольору, відзначають розщеплення сечовини і відсутність E.coli.

5.6.8 Визначання цукролітичних властивостей

Бактерії роду E.coli ферментують вуглеводи (глюкоза, мальтоза, маніт, лактоза, сахароза).

5.6.8.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  МПА (м’ясо-пептонний агар) згідно з А.5 Додатку А цього стандарту;
  •  вуглеводи (малий строкатий ряд): глюкоза згідно з ГОСТ 6038, сахароза згідно з ГОСТ 5833, мальтоза, маніт, лактоза згідно з чинними нормативними документами;
  •  стерильна сироватка крові коней згідно з чинними нормативними документами;
  •  фенолрот згідно з А.23  Додатку А цього стандарту.

5.6.8.2 Методика та правила проведення досліджування

Цукролітичні властивості вивчають за загальноприйнятою методикою з використанням малого строкатого ряду, який готують на щільному середовищі. Індикатором  є фенолрот. На 100 см3 МПА додають 50 см3 сироватки крові, 6 см3 фенолроту у розведенні 1:500 і 1,5 г одного із вуглеводів. Розчин повинен бути малинового кольору або кольору стиглої вишні.

5.6.8.3 Опрацювання результатів

Реакцію вважають позитивною у разі змінення кольору середовища з малинового у жовтий протягом часу від 18 год до 24 год з  моменту посіву. Ферментація може бути уповільненою і проявлятися через 48 год.

5.6.9 Для біохімічної ідентифікації виявлених бактерій дозволено використовувати тест-системи промислового виробництва, у тому числі і закордонні, які зареєстровані на території України, згідно з нормативними документами виробника.

5.7 Серологічні дослідження – реакція аглютинації (РА) на склі

Суть методу полягає у встановленні серологічної групи ізольованих культур E.coli з метою прискорення індикації ентеропатогенних ізолятів.

5.7.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  полівалентні та моновалентні  ОК-сироватки (переважно  серотипи О1, О2, О78, О111, О55) згідно з чинними нормативними документами;
  •  ізотонічний розчин хлориду натрію згідно з А.3 Додатку А цього стандарту;
  •  предметні скельця згідно з ГОСТ 9284;
  •  петля бактеріологічна згідно з чинними нормативними документами.

5.7.2  Правила готування до досліджування

Для РА використовують (2-3) вирощені згідно з 5.5 культури E.coli,, які  не аглютинували з колісироваткою 0157. З цих культур готують суспензії в 0,85 %-ном розчині хлориду натрію, переливають їх у чисті сухі пробірки, встановлюють концентрацію бактерій (2-3) млрд. мікробних клітин/см3, а потім частину суспензії об’ємом (1,5-2) см3 переливають ще в одну чисту суху пробірку. Пробірки з суспензіями одних і тих самих культур бактерій маркують  однаковими номерами, після чого їх піддають термічній обробці: прогріванню у водяній бані за температури 100 °С протягом 1 год  (більшу частину суспензії) та  автоклавуванню  (меншу  частину суспензії)  за температури 121 °С і тиску  1 атм. протягом  2 год. з метою руйнування поверхневого термостабільного А-антигену, який мають деякі штами E.coli серогруп 08, 09, 0101. РА з колі сироватками цих серогруп ставлять з прогрітими за температури 100°С та автоклавованими  антигенами.

5.7.3 Методика та правила проведення досліджування

Підготовлені антигени досліджують у крапельній реакції аглютинації (РА) спочатку з комплексною антиадгезивною сироваткою. На сухе і чисте (знежирене) предметне скло пастерівською піпеткою наносять одну краплю сироватки в робочому розведенні і до неї вносять антиген. Ретельно розмішують, похитуючи скло протягом (1-2) хв. Позитивна РА характеризується склеюванням мікробних клітин у крупні чи дрібні пластівці або зерна однакової величини з повним або частковим просвітленням рідини. Контролем реакції служить досліджувана культура у краплі ізотонічного розчину хлориду натрію. Реакція повинна бути негативною – однорідна каламутна суміш без утворювання пластівців. Культури E.coli, які дали позитивну реакцію з комплексною антиадгезивною сироваткою,  досліджують з сироватками, які входять до набору.

5.7.4 Опрацювання результатів

Позитивну відповідь щодо належності мікроорганізмів до збудників колібактеріозу дають у тому випадку, коли ізольована культура за антигенною структурою відповідає тій або іншій серологічній групі ентеропатогенних  E.coli.

5.8  Біологічне дослідження (постановка біопроби)

Суть методу – визначають патогенні властивості ізольованого штаму.

5.8.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  добова культура, яка досліджується;
  •  фізіологічний розчин згідно з нормативним документом від виробника або згідно з А.3 Додатку А цього стандарту;
  •  білі миші лабораторні або курчата віком від 4 тижнів до 5 тижнів;
  •  шприці медичні (1 см3) згідно з ГОСТ 22967;
  •  голки ін’єкційні згідно з ГОСТ 25377.

5.8.2 Методика та правила проведення досліджування

Трьох білих мишей або курчат заражають інтраперитонеально (у черевну порожнину) сумішшю суспензії агарових культур у фізіологічному розчині, виділених із двох внутрішніх органів в дозі 500 млн. мікробних клітин (за оптичним стандартом  каламутності).

Патологічний матеріал для біопроби на колібактеріоз не використовують.

5.8.3 Опрацювання результатів

Досліджувану культуру вважають патогенною, якщо протягом трьох діб гине одна або більше мишей чи одне або більше курчат – протягом чотирьох діб.

5.9 За необхідності визначають чутливість мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів згідно з методичними вказівками [4].

5.10 Дослідження зразків комбікорму проводять згідно з ДСТУ ISO 4831.

5.11 Бактеріологічний діагноз на колібактеріоз  вважають встановленим у разі одержання таких результатів:

  • виділення культур E.coli не менше ніж з двох таких органів та тканин, як кров із серця, кісткового мозку, головного мозку, відібраних  з свіжого трупа чи вбитої хворої птиці без визначання їхньої патогенності для білих мишей чи курчат і встановлення серогрупової приналежності;
  • виділення із досліджуваного матеріалу культур E.coli, які містять будь-який з адгезивних  антигенів: К88, К99, 987Р, F41, F18, А20;
  • виділення з патогенного матеріалу культур E.coli, які відносяться до патогенних серогруп або мають патогенні властивості для білих мишей чи курчат.

    Pages: 1 2 3 4 5 6 7

Залишити відповідь

Ваша e-mail адреса не оприлюднюватиметься. Обов’язкові поля позначені *

:wink: :twisted: :roll: :oops: :mrgreen: :lol: :idea: :evil: :cry: :arrow: :?: :-| :-x :-o :-P :-D :-? :) :( :!: 8-O 8)