Птахівництво України і cвіту | менеджмент, аналітика, реформи, стандарти


Птиця сільськогосподарська. методи лабораторної діагностики інфекційних хвороб

7 Методи лабораторної діагностики грипу

7.1 Відбирання проб

7.1.1 В лабораторію направляють від чотирьох до п’яти свіжих трупів загиблої або забитої в агональному стані птиці.

Для проведення досліджування по виділенню вірусу від хворої загиблої птиці (у перші 10-12 год після загибелі) відбирають проби патологічного матеріалу (головного мозку, трахеї, легень, кишечнику, селезінки, печінки, нирок).

7.1.2 У разі наявності шлунково–кишкових розладів у хворої птиці проби відбирають стерильним тампоном із слизової клоаки. Проби вносять у пробірки або колби зі стерильним фізіологічним розчином і щільно закривають.

7.1.3 Проби крові досліджуваної птиці для визначення антитіл у сироватці відбирають стерильно з підкрильцевої вени у пробірки, що зволожені фізіологічним розчином. Кров витримують до утворення згустку у термостаті за температури 37,5 оС від 1 год до 2 год, потім обережно обводять голкою або пастерівською піпеткою і залишають на термін від 16 год до 18 год у холодильнику за температури від 2 оС до 4 оС. Прозору сироватку (без гемолізу), яка утворилася, відбирають піпеткою у стерильні пробірки.

7.1.4 Сироватку крові досліджують протягом 3 діб з дня її відбирання. У разі досліджування сироватки у пізніші терміни до неї додають мертіолат натрію в концентрації 1:10000.

7.1.5 Патологічний матеріал і сироватки крові пакують, маркують і транспортують згідно з вимогами [2].

7.1.6 Патологічний матеріал і сироватки крові супроводжують документом відповідної форми, який містить дані щодо епізоотології, клініки захворювання і результати розтинання трупів згідно з [2].

7.1.7 До початку лабораторного досліджування патологічний матеріал і сироватки крові зберігають у холодильнику за температури від 2 оС до 4 оС.

7.2 Патологоанатомічні зміни

Патологоанатомічні зміни різноманітні і залежать від тяжкості захворювання, виду і віку птиці. Труп може бути виснаженим з синюшним відтінком і крововиливами у серозних покривах, скелетній мускулатурі, паранхіматозних органах і на слизовій оболонці кишечнику. Відзначають ураження верхніх дихальних шляхів, відкладення фібрину у повітроносних мішках, риніти, синусити, аеросакуліти, наявність пінистої рідини в отворі трахеї та бронхів, осередкові серозно-катаральні пневмонії. Слизова оболонка дванадцятиперстної і прямої кишок мають катарально-геморагічне запалення, смугасті або крапчасті крововиливи, виразки та некротичні бляшки. Спостерігають ураження яйцепроводів і яєчників.

Наявність наведених патологоанатомічних змін дозволяє встановити попередній діагноз на грип птиці.

7.3 Вірусологічні методи досліджування

Суть методів полягає в ізоляції вірусу і виявленні його патогенної дії на ембріони курей.

7.3.1 Метод виділення вірусу

7.3.1.1 Засоби та допоміжні пристрої

  • термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 оС до 55 оС з точністю +0,5оС;
  • центрифуга лабораторна типу “ОС-6М” або інших модифікацій, яка забезпечує частоту обертів не менше ніж 3000 об/хв згідно з чинними нормативними документами;
  • ваги лабораторні з похибкою зважування не більше 0,01 г згідно з ГОСТ 24104 або інших марок подібного класу точності згідно з чинними нормативними документами;
  • подрібнювач тканини згідно з чинними нормативними документами;
  • овоскоп настільний згідно з чинними нормативними документами;
  • холодильник або холодильна камера, що забезпечують температуру від 0 оС до 4 оС згідно з чинними нормативними документами;
  • колби конічні скляні місткістю 100 см3 згідно з ГОСТ 1770;
  • пробірки скляні місткістю 10 см3, 15 см3 і 20 см3 згідно з ГОСТ 25336;
  • піпетки пастерівські або піпетки скляні вимірювальні місткістю 1 см3, 2 см3, 5 см3 і 10 см3 згідно з ГОСТ 20292;
  • ступка фарфорова згідно з ГОСТ 9147;
  • шприці згідно з ГОСТ 22967;
  • голки згідно з ГОСТ 25377;
  • скло кварцове;
  • фізіологічний розчин, утримуючий 0,85 % хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4);
  • натрію гідроокис згідно з ГОСТ 4328;
  • натрій лимоннокислий тризаміщений згідно з ГОСТ 22280;
  • йод згідно з ГОСТ 4159;
  • антибіотики (пеніцилін, стрептоміцин, ністатин) згідно з [3];
  • парафін згідно з ГОСТ 23683;
  • курячі SPF-ембріони 10-добового віку;
  • суміш 1 % еритроцитів курей у фізіологічному розчині.

7.3.1.2 Правила готування до досліджування

7.3.1.2.1 Суміш 1 % еритроцитів курей у фізіологічному розчині готують таким чином. Беруть кров у півнів чи курей у віці старше ніж 6 місяців з підкрильцевої вени у колбу з фізіологічним розчином у рівних об’ємах з розчином 5 % лимоннокислого натрію. Отриману кров відмивають фізіологічним розчином, осаджуючи центрифугуванням зі швидкістю 1500 об/хв протягом 10 хв. З осаду відмитих еритроцитів готують суспензію 1 % на фізіологічному розчині і зберігають не більше ніж 5 діб у холодильнику за температури 4 оС.

7.3.1.2.2 Патологічний матеріал стерильно виймають з гліцеринового розчину, трикратно споліскують стерильним фізіологічним розчином і гомогенізують у стерильному фізіологічному розчині у співвідношенні 1:5 за допомогою роздрібнювача тканини або роздрібнюють у ступці з кварцовим склом. Гомогенат центрифугують зі швидкістю від 1500 об/хв до 2000 об/хв протягом 20 хв. Надосадову рідину відбирають піпеткою і обробляють антибіотиками для пригнічення сторонньої мікрофлори.

7.3.1.2.3 Оброблювання тампонів. Пробірки (колби) з тампонами струшують від 2 хв до 3 хв, тампони віджимають пінцетом і знищують, потім вміст центрифугують зі швидкістю 2000 об./хв протягом 10 хв.

7.3.1.3 Методика та правила проведення досліджування

Досліджування надосадової рідини, отриманої після обробки кожної проби патологічного матеріалу, проводять шляхом заражування 10 ембріонів віком 10 діб. Контролем є від трьох до 5 незаражених ембріонів.

Перед зараженням ембріони попередньо овоскопують, відзначаючи межу повітряної камери. Збоку ембріона між кровоносними судинами відзначають ділянку для проколювання шкаралупи яйця та інокуляції досліджуваного матеріалу. Шкаралупу зі сторони повітряної камери і місце проколювання дезінфікують 3 % розчином гідроокису натрію або іншими дезінфікувальними розчинами згідно з чинними нормативними документами і обробляють фламбуванням. У центрі повітряної камери і в місці введення досліджуваного матеріалу роблять пробійником отвір, потім через боковий отвір вводять 0,2 см3 досліджуваного матеріалу на глибину від 2 мм до 3 мм в алантоїсну порожнину. Після зараження ембріонів отвори у шкаралупі заливають парафіном. Заражені та контрольні ембріони інкубують за температури 37 оС протягом 72 год. Ембріони, які загинули у перші 24 год, знищують, а решту залишають для подальшої інкубації. Через 72 год інкубації всі ембріони охолоджують за температури 4 оС протягом 18 год і розтинають.

Перед розтином яєць шкаралупу над повітряною камерою дезінфікують розчином 5 % йоду і фламбують, потім акуратно зрізають ножицями і збирають екстраембріональну алантоїсно-амніотичну рідину у стерильні пробірки від кожного ембріона окремо.

Екстраембріональну рідину перевіряють на гемаглютинуючу активність вірусу у крапельній реакції гемаглютинації (РГА), яку ставлять на склі шляхом змішування краплі екстраембріональної рідини з краплею суспензії 1 % еритроцитів курей.

У разі відсутності РГА екстраембріональну рідину у кількості 1,0 см3 від кожного зараженого ембріону з’єднують і повторно заражають 10 курячих SPF-ембріонів віком 10 діб.

Вірус виділяють протягом від трьох до п’яти пасажів на курячих SPF-ембріонах, перевіряючи у кожному пасажі екстраембріональну рідину на наявність гемаглютининів у крапельній РГА. Якщо потрібно визначити гемаглютинаційний титр ізольованого вірусу, необхідно поставити розгорнуту РГА згідно з 7.2.2.

7.3.1.4 Правила опрацювання результатів

Пробу досліджуваного результату вважають негативною, якщо у кількох (від трьох до п’яти) додаткових пасажах не буде виявлено гемаглютинації еритроцитів і патогенної дії вірусу (загибель ембріонів).

У разі наявності гемаглютинації еритроцитів або загибелі ембріонів проводять ідентифікування виділеного вірусу.

7.3.2 Реакція гемаглютинації (РГА)

Суть методу полягає у здатності вірусу грипу птиці аглютинувати еритроцити курей.

7.3.2.1 Засоби та допоміжні пристрої

  •  мікропіпетки згідно з ГОСТ 29227;
  • планшет полімерний для імунологічних реакцій (U-подібний) [4];
  • натрію гідроокис згідно з ГОСТ 4328.

7.3.2.2 Методика та правила проведення досліджування

Готують двократні розведення вірусоутримуючого матеріалу (надосадову рідину, отриману після оброблювання проб патологічного матеріалу згідно з 7.2.1.3) від 1:2 до 1:1024. Для цього в ряд лунок планшетки із плексигласу наливають фізіологічний розчин в об’ємі 0,05 см3. Потім у першу лунку вносять 0,05 см3 вірусу, триразово піпетують і переносять 0,05 см3 суміші в другу лунку і т.д. до необхідного розведення. З останньої лунки 0,05 см3 видаляють у дезінфікувальний розчин (розчин 1 % гідроокису натрію або іншого дезінфікувального розчину).

У кожну лунку додають по 0,05 см3 1 % суспензії курячих еритроцитів. Планшети з лунками струшують і залишають за температури від 18 оС до 20 оС на 30 хв.

Контролем є дві лунки (пробірки) з еритроцитами і фізіологічним розчином в рівних об’ємах (по 0,05 см3 у кожній).

7.3.2.3 Правила опрацювання результатів

Наявність на дні та стінках лунок осаду еритроцитів у вигляді перекинутої „парасольки” свідчить про позитивну РГА.

У разі негативної реакції у досліді і контролі еритроцити утворюють на дні лунок диск з рівними краями.

Титром вірусу вважають обмежений його розвиток, при якому спостерігають повну аглютинацію еритроцитів, що відповідає 1 АО Якщо титр гемаглютининів низький (1:2; 1:4), проводять ще від двох до трьох додаткових пасажів вірусу на курячих ембріонах.

7.3.3 Метод ідентифікації вірусу

Суть методу полягає у можливості специфічних антитіл нейтралізувати гемаглютинуючу здатність вірусу в реакції гальмування гемаглютинації (РГГА) з еталонними специфічними грипозними сироватками і визначенні антитіл у сироватці крові хворої, перехворілої або підозрюваної птиці з еталонними діагностичними антигенами. Для диференціації в реакцію вводять сироватку проти вірусу хвороби Ньюкасла.

7.3.3.1 Засоби та допоміжні пристрої

  • баня водяна згідно з чинними нормативними документами;
  • мікропіпетки згідно з ГОСТ 29227;
  • планшет полімерний для імунологічних реакцій (U-подібний) [4];
  • фізіологічний розчин, утримуючий 0,85 % хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4);
  • дистильована вода згідно з ГОСТ 6709;
  • натрію гідроокис згідно з ГОСТ 4328;
  • спеціальний діагностичний набір, який містить по одній ампулі (флакону) сухих інактивованих антигенів вірусу грипу птиці восьми серологічних варіантів ГПІ-А-(FPV) Roatok/34/ Hav-1; ГП-2А /Chicken/Germany/H/49/ Hav-2; ГП 3-А /Duck/England/56/Hav-3; ГП-4-А /Duck/Czchechoslovakia/56/ Hav-4; ГП-5-А /Tern/South Afrika/61/Hav-5; ГП-6-А/Chicken/USSR/315/70/Hav-6; ГП-7-А /Duck/Ukraine/1/63/Hav-7; ГП-8-А/Turkey/Ontario/6118/Hav-8 (по 2 см2 антигену у кожному розфасуванні);
  • по одній ампулі (флакону) штамоспецифічних імунних сироваток до вищенаведених серологічних варіантів грипу птиці (по 1 см2 у кожному розфасуванні).
  • Імунні сироватки підготовляють таким чином: вміст ампул (флаконів) зі специфічними сироватками розводять дистильованою водою у співвідношенні 1:5. Інактивовані антигени готують так: ампули (флакони) з антигенами розводять фізіологічним розчином (pH 7,2–7,4) до початкового об’єму висушеного вірусу, тобто додають 2,0 см3 фізіологічного розчину.

7.3.3.3 Методика та правила проведення досліджування

Для поставлення основного досліджування у ряд лунок, починаючи з другої, наливають по 0,05 см3 фізіологічного розчину. Потім в першу та другу лунки додають по 0,05 см3 приготовленої специфічної сироватки. Починаючи з другої лунки, сироватку піпетують і переносять 0,05 см3 суміші у третю лунку і т.д. до потрібного розведення. Після цього в усі лунки вносять по 0,05 см3 робочого розведення вірусу (4 АО). Дошки струшують і після 30 хв контакту сироватки з вірусом у кожну лунку додають по 0,1 см3 1 % суспензій еритроцитів.

Для точності обліку РГГА ставлять контроль:

сироватки – для виключення наявності гемаглютинінів до еритроцитів курей (0,05 см3 сироватки, 0,05 см3 фізіологічного розчину і 0,1 см3 1 % суспензії еритроцитів);

стандартних діагностикумів (0,05 см3 2 АО антигену, 0,05 см3 гомологічної йому сироватки і 0,1 см3 1 % суспензії еритроцитів);

еритроцитів – на спонтанну аглютинацію (0,05 см3 фізіологічного розчину і 0,05 см3 1 % суспензії еритроцитів).

Облік результатів проводять візуально через період від 20 хв до 30 хв після осідання еритроцитів у контролі.

7.3.3.4 Правила опрацювання результатів

РГГА вважають позитивною, якщо специфічна грипозна сироватка повністю гальмує гемаглютинуючу активність вірусу (досліджуваного штаму) не менше 1/4 до 1/8 її гомологічного титру.

7.4 Серологічні методи досліджування

7.4.1 Метод визначання специфічних антитіл

Суть методу полягає у знаходженні специфічної здатності антитіл сироватки крові хворої та перехворілої птиці подавляти гемаглютинуючу дію вірусу в РГГА.

7.4.1.1 Засоби та допоміжні пристрої

Для проведення досліду використовують засоби та допоміжні пристрої, які вказані в 7.3.3.1.

7.4.1.2 Правила готування до досліджування

Досліджувані сироватки для знищення термолабільних інгібіторів прогрівають на водяній бані за температури 60 оС протягом 30 хв.

7.4.1.3 Методика та правила проведення досліджування

Готують двократні розведення сироваток на фізіологічному розчині від 1:2 до 1:1024. РГГА ставлять згідно з 7.3.3.3.

Облік реакції проводять через 30 хв після осідання еритроцитів у контролі.

7.4.1.4 Правила опрацювання результатів

Титром сироватки вважають останнє її розведення, яке дає повну затримку гемаглютинації з одним із раніше відомих антигенів.

Виявлення титрів 1:4 і вище в окремих групах птиці дає підставу для проведення вірусологічних досліджень, тобто виділення та ідентифікацію вірусу.

Виділений і типізований із специфічними сироватками вірус є основою для поставлення діагнозу.

7.4.2 Метод імуноферментного аналізу (ІФА)

7.4.2.1 Засоби та допоміжні пристрої

Використовують засоби та допоміжні пристрої згідно з 5.4.4.1 із заміною імуноспецифічних реагентів на такі:

Імуноспецифічні реагенти:

  • планшети із адсорбованими очищеними інактивованими антигенами вірусу грипу птиці восьми серологічних варіантів ГП-І-А-(FPV) Roatok/34/Hav-1; ГП-2-А/Chicken/Germany/H/49/Hav-2; ГП-3-А /Duck/England/ 56/Hav-3; ГП-4-А /Duck/Czchechoslovakia/56/ Hav-4; ГП-5-А/Tern/South Afrika/61/Hav-5; ГП-6-А/Chicken/USSR/315/70/Hav-6; ГП-7-А /Duck/Ukraine/1/ 63/Hav-7; ГП-8-А/Turkey/Ontario/6118/Hav-8;
  • по одній ампулі (флакону) штамоспецифічних імунних сироваток до вищенаведених серологічних варіантів грипу птиці (по 1 см2 у кожному розфасуванні).

Реакцію проводять згідно з 5.3.4 з використанням імуноспецифічних реагентів згідно з 7.4.2.1.

8 Методи лабораторної діагностики хвороби Марека

8.1 Відбирання проб

8.1.1 Для патологоанатомічного досліджування відбирають трупи загиблої або забитої птиці.

8.1.2 Для гістологічного досліджування від кожної загиблої і забитої птиці відбирають проби нервів Plexus brachialis і Truncus ischiadicus, проби з органів з вираженими пухлинними змінами (печінки, нирок, яєчника, залозистого шлунку, серця, легенів, підшлункової залози).

Проби повинні бути розміром не більше ніж 1см х 2 см х 2 см. Відібрані проби фіксують в 10 % нейтральному розчині формаліну і консервують у герметично закритих скляних, пластмасових пляшках або запаковують у запаяні поліетиленові пакети.

8.1.3 Для виділення вірусу відбирають нирки, селезінку і кров від підозрілих у захворюванні і хворих курей.

8.1.4 Для проведення серологічних досліджень проби крові птиці об’ємом від 7 см3 до 10 см3 беруть стерильно із підкрильцевої вени в пробірки, що зволожені фізіологічним розчином. Кров витримують за температури від 18 оС до 20 оС до утворення згустку, потім обережно обводять голкою або пастерівською піпеткою і залишають на 1 год, потім на 1 год ставлять у термостат з температурою 37 оС, після чого – у холодильник за температури 4 оС ще на 1 год. Утворену сироватку відбирають піпеткою у стерильні пробірки.

8.1.5 Проби запаковують в коробку і доставляють в лабораторію із супровідним документом, в якому .вказують час загибелі або забою птиці, її вік, а також епізоотичний стан в господарстві згідно з вимогами [2].

8.2 Патологоанатомічні зміни

Тушки оглядають зовні, відзначаючи ураження шкіри. Потім шкіру знімають і оцінюють стан скелетної мускулатури (шиї, грудних м’язів, поверхонь стегон). Після цього птицю розтинають і оцінюють стан органів черевної порожнини, включаючи фабрицієву бурсу, а також основних нервових стовбурів у такій послідовності: в області шиї – N. vagus і N. cervicalis, блукаючого нерва, який проходить в брижейці між печінкою і залозистим шлунком; Pl. coeliacus, розташованого в області A. coeliaca каудальної гілки N. intestinalis, а також Pl. ischiadicus, Pl. brachialis і Pl. lumbales.

8.2.2 Правила опрацювання результатів

Хворобу Марека встановлюють у разі виявлення:

  • змінення нервів у вигляді потовщень, втрати поперечної смугастості або вузлового пухлиноподібного збільшення в об’ємі;
  • змінення очей у вигляді деформації зіниці зі зміненням кольору райдужної оболонки або без її змінення (класична форма);
  • змінення шкіри у вигляді численних до розміру з горошину пухлиноподібного потовщення фолікулів пір’я, а також дифузно пухлиноподібного потовщення шкіри, частково з некрозами;
  • пухлин в органах у вигляді дрібних численних осередків, дифузного набрякання або пухлинних вузлів у птиці віком 6 місяців;
  • пухлин у поєднанні зі зміненнями нервів, очей або пухлино подібними зміненнями шкіри.

За наявності пухлин в органах птиці старше від п’ятимісячного віку, які не мають змінень нервів, очей або шкіри, хворобу Марека відрізняють від лімфоїдного лейкозу на підставі:

  • відмінностей у середній частоті прояву пухлин в різних органах птиці, хворої на хворобу Марека і лімфоїдний лейкоз у відповідності з табл. 2.
  • відмінностей у патологоанатомічній картині змінень органів у разі хвороби Марека і лімфоїдному лейкозі і наявності пухлин у фабрицієвій бурсі при лімфоїдному лейкозі згідно з табл. 3.

 Таблиця 2 – Проява пухлин у різних органах птиці хворої на хворобу Марека і лімфоїдний лейкоз

Назва органу

Хвороба Марека*

Лімфоїдний лейкоз
Фабрицієва бурса

+

++++

Печінка

++++

++++

Селезінка

+++

++++

Нирки

+++

++++

Яєчник

+++

++++

Серце

+++

+

Легені

+++

+

Залозистий шлунок

+++

+

Підшлункова залоза

++

++

Брижейка

++

++

Волова залоза

+

++

Скелетна мускулатура

++

+

Шкіра

+(+++)**

 

Примітки. Прийняті позначення:

++++ пухлини виявляються у 50 % птиці і більше;

+++ пухлини виявляються у 15 % до 50 % птиці;

++ пухлини виявляються у 5 % до 15 % птиці;

+ пухлини виявляються менше ніж у 5 % птиці.

* Частота ураження органів може змінюватися в залежності від тяжкості патологічного процесу і прояву асоційованої форми хвороби Марека.

** Для бройлерів.

Таблиця 3

Назва

органу

Хвороба Марека*

Лімфоїдний лейкоз

Печінка

Досить незначне до середнього збільшення з дрібними осередково-дисемінованими пухлинами, часто нечітко обмеженими, розміром від шпилькової головки до сочевиці (рівномірна гранітоподібна крапчастість) або нерівномірні дифузно-інфільтруючі змінення у вигляді малюнку географічної карти або (дуже рідко) збільшення пухлинних вузлів

 

Дуже часто значне до надзвичайно вираженого збільшення дрібними осередково-дисемінованими зміненнями у вигляді, частіше всього, чітко обмежених і густо розсіяних пухлинних вузликів, розміром переважно як шпилькова головка до розміру перчинки (рівномірно і густо дрібнозерниста поверхня розрізу) або рівномірно дифузно-інфіль-труюча зміна у вигляді рівномірного надзвичайно сильного набрякання і освітлення або пухлинних вузлів

Селезінка

Найчастіше дифузне набрякання з нечіткою структурою поверхні розрізу і (або) пухлинні вузлики

Набрякання або множинні одноманітні пухлинні вузлики (подібні до вузликів у печінці)

Яєчник

Відносно міцні щільні пухлини

Відносно м’які щільні пухлини

Брижейка

 

 

Нерівномірні дифузні до товстошкірих змінення (у вигляді спайки) або пухлинні вузлики різної величини

Множинні дрібні пухлинні вузлики (подібні до вузликів у печінці) або м’які дрібновузликові до дифузних змінення

Кінець таблиці 3

Назва

органу

Хвороба Марека*

Лімфоїдний лейкоз

Залозистий шлунок

Часто зміни у вигляді пухлинного набрякання фолікулів, залоз, а також вузликові або дифузні пухлиноподібні змінення слизової оболонки або по всій стінці, часто з виразками

Дуже рідко зміни у вигляді незначних до помірно сильних пухлиноподібних набряків, перш за все у переході слизової оболонки стравоходу до слизової оболонки залозистого шлунку

Фабрицієва бурса

Дуже часто атрофія.

Рідко помірне потовщення складок.

Дуже рідко велика пухлина.

У птиці на стадії розвитку фабрицієвої бурси часто спостерігають:

 

– пухлинні вузлики в складках і (або) в стінці;

– нерівномірне дифузне пухлиноподібне потовщення складок;

– перетворення фабрицієвої бурси у велику пухлину.

У птиці на стадії зворотного розвитку фабрицієвої бурси часто замість фабрицієвої бурси – пухлина розміром від сочевиці до гусячого яйця

У випадку лімфоїдного лейкозу на відміну від хвороби Марека в середньому до 60 % випадків фабрицієва бурса переважно уражується пухлиноподібними зміненнями. Тому в практиці діагностики за наявності пухлин фабрицієвої бурси у птиці, починаючи з шестимісячного віку, можна попередньо ставити діагноз – лімфоїдний лейкоз.

Диференціальну діагностику хвороби Марека і лімфоїдного лейкозу на

основі даних патологоанатомічних досліджень з урахуванням віку проводять згідно з табл. 4.

 Таблиця 4 – Диференціальна діагностика хвороби Марека і лімфоїдного лейкозу

Патологічні зміни

Діагноз

Змінення нервів або очей

Хвороба Марека

Змінення шкіри (вузликоподібні, пухлиноподібні потовщення фолікулів пера)

Хвороба Марека

Пухлини в органах у поєднанні зі зміненнями нервів, очей або шкіри

Хвороба Марека

Пухлини фабрицієвої бурси з пухлинами або без пухлин в інших органах:

 

починаючи з 5-місячного віку

Лімфоїдний лейкоз

у віці до 5 місяців

Хвороба Марека

Пухлини в органах без пухлин фабрицієвої бурси у віці до 5 місяців

Хвороба Марека

починаючи з п’ятого місяця життя зі зміненнями згідно з табл. 1 і 2, графа „Хвороба Марека”

Хвороба Марека

змінення згідно з табл. 1 і 2, графа „Лімфоїдний лейкоз”

Лімфоїдний лейкоз

8.3 Гістологічний метод

Суть методу полягає у знаходженні специфічних для хвороби Марека патологогістологічних змін і диференціації їх від змін при лімфоїдному лейкозі.

8.3.1 Засоби та допоміжні пристрої

  • мікротом заморожуючий або парафіновий згідно з чинними нормативними документами;
  • мікроскоп марки “Биолам Д-11” або аналогічний згідно з ГОСТ 8074;
  • скло предметне згідно з ГОСТ 9284;
  • скло покривне згідно з ГОСТ 6672;
  • парафін (з точкою плавлення 58 оС) згідно з ГОСт 23683;
  • спирт етиловий ректифікований згідно з ДСТУ 4221;
  • метилбензоат згідно з чинними нормативними документами;
  • бензол згідно з ГОСТ 5955;
  • гематоксилін;
  • еозин згідно з чинними нормативними документами;
  • ксилол згідно з чинними нормативними документами;
  • ацетон згідно з ГОСт 2603;
  • карбол-ксилол згідно з чинними нормативними документами;
  • бальзам для заливання згідно з ГОСТ 2290.

8.3.2 Методика та правила проведення досліджування

Із проб органів, фіксованих у формаліні, готують заморожені або парафінові зрізи, які фарбують гематоксилін-еозином або іншими барвниками і вивчають під мікроскопом.

8.3.3 Правила опрацювання результатів

Результати гістологічних досліджень оцінюють відповідно до табл. 5.

Таблиця 5 – Результати гістологічних досліджень

Порівняльні гістологічні дані

Хвороба Марека

Лімфоїдний лейкоз

Гістологічні дані в результаті пухлиноподібних змінень

Переважні гетероморфні інфільтрати і проліферати з лімфоцитів, пролімфоцитів, лімфобластів і ретикулярних клітин, іноді з домішкою фібробластів, гістіоцитів, плазматичних клітин. Рідко мономорфні проліферати, які складаються з клітин типу лімфоїдного ряду

Мономорфні проліферати із лімфобластів

Гістологічні дані ранніх змінень:  
нервів

Набряки, навколосудинні дифузні лімфоїдні проліферати

Змінень немає
фабрицієвої бурси

Міжфолікулярні проліферати і/або дегенерація фолікулів з утворенням кіст

Внутрішньофолікулярні проліферати із лімфобластів зі стертою внутрішньою структурою фолікулів

селезінки Нерівномірні, часто навколоартеріальні вогнища проліферації

Внутрішньофолікулярні проліферати із лімфобластів

печінки, нирок та інших органів

Частіше за все нерівномірні вогнища проліферації, які утворюються спочатку навколо судин

Фолікулоподібні вогнища проліферації із лімфобластів

8.4 Вірусологічний метод досліджування

Суть методу полягає в ізоляції вірусу з тканин нирок хворої або підозрілої у зараженні птиці і наступній ідентифікації його серологічним методом.

8.4.1 Засоби та допоміжні пристрої

  • термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 оС до 55 оС з точністю +0,5оС;
  • магнітна мішалка ММ 3М або подібного типу, що призначена для перемішування рідин у хімічних лабораторіях згідно з чинними нормативними документами;
  • центрифуга лабораторна типу “ОС-6М” або інших модифікацій, яка забезпечує не менше 3000 об/хв згідно з чинними нормативними документами;
  • марля згідно з ГОСТ 9412;
  • пробірки скляні місткістю 10 см3, 15 см3 і 20 см3 згідно з ГОСТ 25336;
  • піпетки пастерівські місткістю 1 см3, 2 см3, 5 см3 і 10 см3 згідно з ГОСТ 20292;
  • колби конічні скляні місткістю 50 см3 і 100 см3 згідно з ГОСТ 1770;
  • флакони для культури клітин місткістю 50 см3, 100 см3, 200 см3 і 500 см3 із нейтрального скла згідно з чинними нормативними документами;
  • розчин Хенкса;
  • трипсин, 0,25 % розчин;
  • пожне середовище № 199 згідно з чинними нормативними документами;
  • сироватка теляча ембріональна.

8.4.2 Методика та правила проведення досліджування

З тканин нирок щойно забитої хворої птиці вирізають шматочки розміром від 2 см3 до 3 см3, які відмивають розчином Хенкса і додають 0,25 % розчин трипсину у співвідношенні 1:10. суспензію змішують на магнітній мішалці протягом часу від 20 хв до 30 хв, фільтрують через 2 шари марлі і центрифугують протягом 15 хв з частотою обертання 1000 об/хв, потім її готують в середовищі росту, що вміщує в 1 см3 800 тис. клітин, висівають у флакони і інкубують у термостаті за температури 37 °С.

8.4.3 Правила опрацювання результатів

За наявності вірусу проявляється цитопатична дія (ЦПД) у вигляді утворення вогнищ (фокусів), що складаються зі скупчення заокруглених рефрактильних клітин (через 48-72 год), синцитію і мікроскопічних бляшок – негативних плям (через проміжок часу від 90 год до 120 год). Термін появи ЦПД залежить від дози вірусу і кількості проведених пасажів. Уразі первинного культивування збудника специфічні морфологічні змінення клітин проявляються частіше у другому і третьому пасажах вірусоутримуючого матеріалу протягом часу від 48 год до 96 год. Специфічність ЦПД підтверджують досліджуванням окремих проб матеріалу в реакції преципітації (РДП) в агаровому гелі з імунною сироваткою.

8.5 Серологічні методи досліджування

8.5.1 Р еакція дифузної преципітації (РДП)

Суть методу полягає у виявленні антитіл до вірусу хвороби Марека або

антигену цього вірусу в реакції преципітації в агаровому гелі.

8.5.1.1 Засоби та допоміжні пристрої

  • термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 оС до 55 оС з точністю +0,5оС ;
  • автоклав згідно з чинними нормативними документами;
  • посудина Дьюара згідно з чинними нормативними документами;
  • термометр скляний рідинний згідно з ГОСТ 28498 з діапазоном вимірювання від 0 оС до 100 оС або аналогічний з межею допустимої похибки вимірювання ±1 оС згідно з чинними нормативними документами;
  • чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
  • скло предметне згідно з ГОСТ 9284;
  • колби конічні скляні місткістю 50 см3 або 100 см3 згідно з ГОСТ 1770;
  • флакони місткістю 50 см3, 100 см3 із нейтрального скла згідно з чинними нормативними документами;
  • фізіологічний розчин, утримуючий 0,85 % хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4);
  • вода дистильована згідно з ГОСТ 6709;
  • натрій хлористий згідно з ГОСТ 4233;
  • агар мікробіологічний згідно з ГОСТ 17206;
  • натрію гідроокис згідно з ГОСТ 4328;
  • мертіолат згідно з чинними нормативними документами;
  • специфічний тест-антиген вірусу хвороби Марека з титром від 1:8 до 1:16;
  • специфічна преципітуюча тест-сироватка до хвороби Марека (наприклад, від спонтанно захворілої птиці) з титром від 1:8 до 1:16;
  • контрольний антиген негативний;
  • контрольна сироватка негативна;
  • поживні середовища (середовище 199, середовище Ігла) для культивування культури клітин SPF-ембріонів;
  • середовище підтримуюче.

8.5.1.2 Правила готування до досліджування

Гель 1 % агару готують таким чином: беруть 10 г високоякісного очищеного агару, 80 г хлористого натрію і доводять дистильованою водою до 1000 см3. Суміш автоклавують при 1 атм протягом 30 хв, фільтрують через 2 шари марлі і доводять pH суміші за допомогою 10 % розчину гідроокису натрію до рівня від 7,2 до 7,4. Середовище консервують мертіолатом (0,01 % до загального об’єму), розливають у колби або скляні флакони по 50 см3 або 100 см3, охолоджують і зберігають за температури від 2 °С до 4 °С. В цих умовах середовище зберігають до 14 діб.

Для досліджування в РДП в агаровому гелі із епітелію фолікулів пір’я готують суспензію таким чином: із зовнішньої поверхні стегна і крил забитої птиці вискубують від десяти до п’ятнадцяти пір’їн. Утворююча тканина всередині фолікулів пера обов’язково повинна бути збережена. Фолікули пера з епітеліальними клітинами використовують для отримання суспензії і з них готують екстракт для серологічного дослідження (індикація антигену). Колодочки пера подрібнюють на шматочки і розтирають у гомогенізаторі чи у ступці зі стерильним піском або заморожують у рідкому азоті в посудині Дьюара. Потім їх заливають фізіологічним розчином у співвідношенні 1:10 і екстрагують протягом 24 год за температури 4 °С. Надосадову рідину екстракту досліджують в РДП.

8.5.1.3 Методика та правила проведення досліджування

Для постановки РДП агарове середовище розплавляють на водяній бані за температури від 60 °С до 65 °С, розливають у 2 чашки Петрі або наносять на предметне скло, щоб товщина шару агару була не менше ніж 2 мм.

В агаровій пластинці роблять 6 лунок у вигляді шестикутника і одну лунку в центрі. 6 лунок діаметром 4 мм повинні розміщуватися по колу на відстані 2 мм одна від одної і від краю центральної лунки.

Щоб уникнути підтікання антигену і сироватки під агар дно лунок обережно розплавляють або в кожну лунку вносять невелику кількість розплавленого агару. У двошаровому агарі лунки пробивають тільки у верхньому шарі.

Для виявлення специфічних антитіл у сироватці крові в центральну лунку вносять специфічний вірусний антиген, а в периферійні лунки – досліджувані сироватки. Специфічний антиген готують із пір’яних фолікулів птиці, експериментально інфікованих вірусом хвороби Марека.

Для контролю застосовують:

  • специфічний вірусний антиген плюс специфічна сироватка;
  • специфічний вірусний антиген плюс контрольна сироватка (негативна);
  • специфічний вірусний антиген плюс фізіологічний розчин.

Для виявлення вірусного антигену в центральну лунку вносять специфічну сироватку, а у периферійні лунки – досліджуваний матеріал. При цьому необхідно використовувати екстракт із пір’яних фолікулів спонтанно захворілої птиці або клітинну культуру, заражену вірусом.

Для контролю застосовують:

  • специфічну сироватку плюс специфічний вірусний антиген;
  • специфічну сироватку плюс контрольний антиген (негативний).

Після заповнення лунок компонентами закриті чашки або предметне скло поміщають у термостат за температури 37 °С.

Облік результатів проводять через 24 год, 48 год і 72 год.

8.5.1.4 Правила опрацювання результатів

Реакцію на чашках Петрі і предметному склі визначають у похило спрямованому пучку світла на темному фоні. Спочатку реєструють контрольні лінії преципітації, які повинні з’являтися між лунками зі специфічним антигеном і специфічною сироваткою. Проби з лініями преципітації вважають позитивними.

Реакцію вважають позитивною у разі утворення ліній преципітації між лунками з досліджуваним матеріалом і специфічним антигеном або сироваткою за умови відсутності ліній преципітації з негативними антигенами і сироваткою.

8.5.2 Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА)

8.5.2.1 Використовують засоби та допоміжні пристрої згідно з 6.4.5.1 із заміною еритроцитарного дагностикуму для інфекційного бронхіту на еритроцитарний діагностикум для хвороби Марека.

8.5.2.2 Реакцію РДП проводять згідно з 6.4.5 із використанням еритроцитарний діагностикум для хвороби Марека.

Pages: 1 2 3 4 5 6

Залишити відповідь

Ваша e-mail адреса не оприлюднюватиметься. Обов’язкові поля позначені *

:wink: :twisted: :roll: :oops: :mrgreen: :lol: :idea: :evil: :cry: :arrow: :?: :-| :-x :-o :-P :-D :-? :) :( :!: 8-O 8)