Птиця сільськогосподарська. методи лабораторної діагностики інфекційних хвороб

 5 Методи лабораторної діагностики інфекційного ларинготрахеїту

5.1 Відбирання проб

5.1.1 В лабораторію направляють від 4 голів до 5 голів свіжих трупів і клінічно хвору птицю.

Для вірусологічного досліджування відбирають проби патологічного матеріалу – частину слизової оболонки гортані, трахеї, кон’юнктиви, носових ходів (включаючи ексудати) і легень від щойно загиблої або забитої з діагностичною метою птиці у початковій фазі її захворювання (від другої до сьомої доби).

5.1.2 Для серологічного досліджування відбирають кров не менше ніж від 10 голів птиці по 5 см3 на 14 добу і 28 добу від початку хвороби.

Кров беруть з підкрильцевої вени, яку протирають етиловим спиртом 70 %. Проби крові набирають в окремі пронумеровані пробірки, попередньо зволожені стерильним фізіологічним розчином. Утворений згусток обводять тонким металевим стержнем або скляною паличкою, потім пробірки вносять у термостат на час від 20 хв до 30 хв за температури 37 ^оС. Проби крові витримують у холодильнику за температури 4 ^оС до утворення сироватки. Відстояну сироватку зливають у чисті пронумеровані пробірки.

5.1.3 Відібрані проби заморожують і до проведення досліджування зберігають за температури не вище ніж мінус 20 оС. До сироватки крові, призначеної для зберігання, консерванти не додають.

5.1.4 Патологічний матеріал і сироватки крові пакують, маркують і транспортують згідно з вимогами [2].

5.1.5 Патологічний матеріал і сироватки крові супроводжують документом відповідної форми, який містить дані щодо епізоотології, клініки захворювання і результати розтинання трупів згідно з вимогами [2].

5.2 Патологоанатомічні зміни

Під час гострого перебігу хвороби на розтині ротової порожнини виявляють наліт, який легко відділяється. Слизова оболонка трахеї геморагічно запалена, набрякла, іноді можна виявити згусток крові в її отворі, а також накопичення слизу, змішаного з казеозними масами, що призводить до загибелі птиці. Іноді спостерігають венозний застій крові у легенях, катарально-геморагічне запалення тонкого відділу кишечнику, фабрицієвої сумки та клоаки.

Наявність наведених патологоанатомічних змін дозволяє встановити попередній діагноз на інфекційний ларинготрахеїт.

5.3 Вірусологічні методи досліджування

5.3.1 Метод виділення вірусу

Суть методу полягає у виділенні збудника захворювання на курячих ембріонах або на культурі клітин.

5.3.1.1 Засоби та допоміжні пристрої

• термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 ^оС до 55 ^оС з точністю +0,5^оС або інкубатор, що забезпечує температуру нагрівання від 37 ^оС до 38 ^оС згідно з чинними нормативними документами;
• овоскоп настільний згідно з чинними нормативними документами;
• ступки фарфорові згідно з ГОСТ 9147;
• центрифуга лабораторна типу “ОС-6М” або інших модифікацій, яка забезпечує частоту обертів не менше ніж 3000 об/хв згідно з чинними нормативними документами;
• подрібнювач тканини марки РТ-2 або інших модифікацій, які призначенні для подрібнення тканини для медичних та лабораторних цілей;
• холодильник або холодильна камера, що забезпечують температуру від 0 ^оС до 4 ^оС згідно з чинними нормативними документами;
• пробірки скляні згідно з ГОСТ 25336;
• флакони медичні згідно з чинними нормативними документами;
• шприці згідно з ГОСТ 22967;
• голки згідно з ГОСТ 25377;
• скло кварцове подрібнене або стерильний дрібний річковий пісок;
• пеніцилін згідно з [3];
• стрептоміцин згідно з [3];
• курячі SPF-ембріони десятидобового віку;
• культура клітин нирок курячих SPF-ембріонів та курчат, вільних від антитіл до вірусу інфекційного ларинготрахеїту;
• фізіологічний розчин, утримуючий 0,85 % хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4).

5.3.1.2 Правила готування до досліджування

Проби патологічного матеріалу, відібрані для виділення вірусу, гомогенізують з додаванням фізіологічного розчину у співвідношенні 1:5 за допомогою подрібнювача тканини або у ступці з кварцовим склом. Суміш центрифугують з частотою обертів від 1500 об/хв до 2000 об/хв протягом часу від 10 хв до 15 хв. Надосадову рідину зливають у колби чи флакони, додають по 1000 ОД пеніциліну і стрептоміцину на 1 см3 суспензії і витримують у холодильнику за температури від 2 ^оС до 4 ^оС протягом від 3 год до 12 год

5.3.1.3 Методика та правила проведення досліджування на курячих ембріонах

Для кожної проби використовують по 10 курячих ембріонів. Отриману після обробляння суспензію у кількості 0,2 см³ інокулюють на хоріоалантоїсну оболонку або в хоріоалантоїсну порожнину. Заражені ембріони одночасно з контрольними інкубують у термостаті або інкубаторі за температури 37,5 ^оС протягом 8 діб. Ембріони овоскопують 2 рази на добу. Ембріони, які загинули у перші 24 год, знищують, а ембріони, які загинули пізніше, відбирають і зберігають у холодильнику за температури 4 ^оС. Останні живі ембріони вбивають на 6 добу після зараження охолодженням протягом часу від 2 год до 3 год за температури 4 ^оС.

У разі відсутності у першому пасажі специфічних уражень курячого ембріону проводять додатково від двох до трьох пасажів. Для наступного пасажу вірусу використовують для зараження хоріоалантоїсну оболонку, суспензійовану в алантоїсній рідині, і весь ембріон.

5.3.1.4 Правила опрацювання результатів

Загибель ембріонів протягом часу від 4 діб до 6 діб свідчить про наявність вірулентного штаму вірусу інфекційного ларинготрахеїту. Загибель ембріонів пізніше вказаних термінів або відсутність розвитку ембріонів за розмірами і масою свідчить про зараження менш вірулентними штамами вірусу.

Специфічні ураження курячих ембріонів, які загинули протягом часу від 3 діб до 5 діб після зараження, характеризують такими ознаками: помутніння і потовщення хоріоалантоїсної оболонки, наявність дрібних (дрібнозернисті, величиною від 1 мм до 4 мм) або крупних (діаметром від 5 мм до 7 мм) бляшок від сірого до жовтувато-білуватого кольору різної морфології – круглі, пласкі або неправильної форми.

Вірус ідентифікують методами поставлення біопроби і серологічними досліджуваннями (РН, РДП, метод флуоресціюючих антитіл).

5.3.2 Метод поставлення біопроби

5.3.2.1 Суть методу полягає у відтворенні інфекційного ларинготрахеїту на курчатах. Метод дозволяє визначити вірулентність штаму, а також провести диференціацію його від вірусів, які викликають схоже ураження хоріоалантоїсної оболонки у інфікованих курячих ембріонів.

5.3.2.2 Засоби та допоміжні пристрої

• курчата віком від 1 місяця до 2,5 місяців;
• вірусоутримуючий матеріал згідно з 5.3.1.2;
• піпетки пастерівські згідно з ГОСТ 29227.

5.3.2.3 Методика та правила проведення досліджування

Біологічну пробу ставлять на десяти курчатах віком від 1 місяця до 2,5 місяців шляхом внутрішньотрахейної аплікації вірусоутримуючого матеріалу і втирання його в слизову оболонку клоаки.

Щоб виключити можливість наявності вірусу віспи курей, який викликає на хоріоалантоїсній оболонці ураження, схожі з вірусом інфекційного ларинготрахеїту, курчат заражають методом аплікації вірусоутримуючого матеріалу у скарифіковані пір’яні фолікули гомілки та гребінь.

5.3.2.4 Правила опрацювання результатів

За курчатами, які вижили, спостерігають протягом часу від 10 діб до 14 діб.

Інфекційний ларинготрахеїт діагностують у разі появи у заражених курчат клінічних ознак: кашлю, хрипів, уражень гортані, риніту. Це відбувається у період від 3 доби до 7 доби, але не пізніше 12 доби.

У птиці, яка заражена в клоаку, спостерігають запалення слизової оболонки. Деякі менш вірулентні штами, навіть у великих дозах, викликають лише хрипи і витікання з носових отворів. Реакція на віспу у зараженої птиці з’являється на 6-8 добу в формі припухання, почервоніння фолікул і утворення несправжніх дифтеритних утворювань у ротовій порожнині. При вірусоскопії за методом Морозова у мазках з розвинутих фолікул виявляють елементарні тільця віспи.

5.4 Серологічні методи досліджування

Суть методів полягає у виявленні у перехворілої птиці специфічних антитіл в реакції нейтралізації (РН), реакції дифузної преципітації в агаровому гелі (РДП), імуноферментним аналізом (ІФА).

5.4.1 Реакція нейтралізації (РН)

Суть методу полягає у виявленні специфічних антитіл у птиці в РН.

5.4.1.1 Засоби та допоміжні пристрої

• водяна баня;
• термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 ^оС до 55 ^оС з точністю +0,5^оС ;
• холодильник з морозильною камерою згідно з чинними нормативними документами, яка забезпечує температуру від мінус 18 ^оС до мінус 24 ^оС;
• центрифуга лабораторна типу “ОС-6М” або інших модифікацій, яка забезпечує частоту обертів не менше ніж 3000 об/хв згідно з чинними нормативними документами;
• штативи лабораторні для пробірок;
• пальники газові або спиртові;
• подрібнювач тканини марки РТ-2 або інших модифікацій, які призначенні для подрібнення тканини для медичних та лабораторних цілей;
• термометр скляний рідинний згідно з ГОСТ 28498 з діапазоном вимірювання від 0 ^оС до 100 ^оС з межею допустимої похибки вимірювання ±1 ^оС;
• корки гумові згідно з чинними нормативними документами;
• пробірки бактеріологічні місткістю 20 см³ згідно з ГОСТ 1770;
• піпетки градуйовані місткістю 1 см³, 2 см³, 5 см³, 10 см³ і 100 см³ згідно з ГОСТ 29227;
• скло предметне згідно з ГОСТ 9284;
• фізіологічний розчин, утримуючий 0,85 % хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4);
• пеніцилін згідно з [3];
• стрептоміцин згідно з [3];
• курячі SPF-ембріони десятидобового віку;
• культура клітин нирок курячих SPF-ембріонів і курчат, вільних від антитіл до вірусу інфекційного ларинготрахеїту;
• середовища поживні для культури клітин (середовище 199, середовище Ігла) згідно з чинними нормативними документами;

5.4.1.2 Правила готування до досліджування

Антиген для проведення РН готують з курячих SPF-ембріонів, хоріоалантоїсна оболонка яких має змінення, характерні для цього вірусу. Хоріоалантоїсну оболонку гомогенізують з однаковою кількістю фізіологічного розчину, до якого додані антибіотики з розрахунку по 100 ОД пеніциліну і стрептоміцину на 1 см³ розчину. Суспензію центрифугують протягом 10 хв з частотою обертів від 1500 об/хв до 2000 об/хв.

Надосадову рідину зливають і використовують як антиген, якщо вона містить вірусу не менше ніж 105 ЕІД50/см³. До використання антиген зберігають в запаяних ампулах у замороженому стані.

Сироватки крові (хворої та перехворілої птиці, контрольні позитивні та негативні сироватки птиці) інактивують на водяній бані за температури 56 ^оС протягом 30 хв. До початку досліджування зберігають у замороженому стані.

5.4.1.3 Методика та правила проведення досліджування

РН проводять на курячих SPF-ембріонах або на культурах клітин SPF-ембріонів, використовуючи постійну кількість сироватки і прогресивно зростаючі десятикратні розведення вірусу-антигену.

РН проводять відповідно до таблиці 1.

Таблиця 1 – Використання постійної кількості сироватки і зростаючого розведення вірусу-антигену в РН

№ ря-ду	Номер про-бірки	Норма-льна сироват-ка, см3	Імунна сироватка, см3	Розведення вірусу
				1:5	1:50	1:500	1:5000	1: 50000
1	1	0,5	–	0,5
	2	0,5	–		0,5
	3	0,5	–			0,5
	4	0,5	–				0,5
	5	0,5	–					0,5
2	1	–	0,5	0,5
	2	–	0,5		0,5
	3	–	0,5			0,5
	4	–	0,5				0,5
	5	–	0,5					0,5

У штатив ставлять декілька рядів стерильних пробірок. Кількість рядів відповідає кількості досліджуваних сироваток, а кількість пробірок в ряду – кількості розведень вірусного антигену. В усі пробірки з ряду вносять по 0,5 см3 відповідної сироватки. Паралельно з цим ставлять контрольний дослід з нормальною (відомою негативною) та імунною (відомою позитивною) сироватками проти інфекційного ларинготрахеїту з такою самою дозою. Потім в усі пробірки з досліджуваними і контрольними сироватками додають по 0,5 см3 відповідних десятикратних розведень вірусного антигену. Антиген можна розливати однією і тією самою піпеткою, якщо починати з найбільшого розведення. Пробірки струшують і залишають за кімнатної температури протягом доби.

Кожним розведенням в об’ємі 0,2 см³ інокулюють від 4 ембріонів до 5 ембріонів (або від 4 пробірок до 5 пробірок культури клітин) шляхом інокуляції на хоріоалантоїсну оболонку або в хоріоалантоїсну порожнину. Ембріони інкубують протягом 6 діб за температури 37 оС з щоденним овоскопуванням один або 2 рази на добу. Загиблі ембріони у перші 24 год відкидають, а ті, що залишилися, розтинають на шосту добу для виявлення специфічних змін на поверхні хоріоалантоїсної оболонки.

В РН використовують нерозведені сироватки, щоб не виникли небажані розходження між індексами нейтралізації однієї і тієї самої сироватки, використаної у розведеному і нерозведеному стані. У разі недостатньої кількості сироватки її розводять до необхідного мінімуму (1:2, 1:3, тощо). У цьому випадку отриманий індекс нейтралізації помножують на відповідний фактор розведення.

5.4.1.4 Правила опрацювання результатів

EID50 в ембріонах або ID50 у культурах тканин обчислюють окремо для кожної сироватки на підставі отриманих результатів РН і визначають індекс нейтралізації – різницю між логарифмічними показниками титрів вірусу в присутності нормальної (негативної) та імунної (позитивної) сироваток, яку обчислюють згідно з методикою Ріда і Менча. Визначене за таблицею антилогарифмів число і буде індексом нейтралізації.

Вірусний ізолят, який нейтралізується позитивною сироваткою проти інфекційного ларинготрахеїту з індексом вище ніж 50, ідентифікують як вірус інфекційного ларинготрахеїту.

Сироватку з індексом нейтралізації 10 або менше в РН з відомим штамом вірусу інфекційного ларинготрахеїту вважають негативною, сироватку з індексом від 11 до 49 – сумнівною, з індексом 50 і вище – позитивною.

5.4.2 Реакція дифузної преципітації (РДП)

Суть методу полягає в утворенні ліній преципітації в місцях зустрічання дифундуючих у гелі специфічних антитіл і антигену.

5.4.2.1 Засоби та допоміжні пристрої

• водяна баня;
• холодильник або холодильна камера, що забезпечують температуру від 0 ^оС до 4 ^оС згідно з чинними нормативними документами;
• антисироватки типоспецифічні до інфекційного ларинготрахеїту, позитивні;
• контрольна сироватка (негативна);
• чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
• термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 ^оС до 55 ^оС з точністю +0,5^оС;
• термометр скляний рідинний згідно з ГОСТ 28498 з діапазоном вимірювання від 0 ^оС до 100 ^оС з межею допустимої похибки вимірювання ±1 ^оС;
• штамп для виготовлення лунок в агарі;
• агар очищений згідно з ГОСТ 17206;
• штами еталонні вірусу інфекційного ларинготрахеїту;
• фізіологічний розчин, утримуючий 0,85 % хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4);
• вода дистильована згідно з ГОСТ 6709;
• веронал згідно з [3];
• мединал згідно з [3];

5.4.2.2 Правила готування до досліджування

Проби сироватки крові інактивують прогріванням на водяній бані за температури 56 ^оС протягом 30 хв.

1,5 % агаровий гель готують на фізіологічному розчині з рН 7,2 таким чином: в 100 мл гарячої дистильованої води розчиняють 1,84 г вероналу, після охолодження доливають дистильовану воду до 1000 мл і розчиняють в отриманому розчині 10,3 г мединалу. Розчин зберігають у холодильнику за температури 4 ^оС.

Антиген отримують із гомогенізованих хоріоналантоїсних оболонок загиблих курячих ембріонів, інокульованих адаптованим до них штамом.

5.4.2.3 Методика та правила проведення досліджування

Агар наливають у чашки Петрі. Штампом роблять 3 лунки (заглиблення) діаметром 4 мм або 6 мм на відстані 4 мм одна від одної. На дно кожної лунки вносять краплю розплавленого агару. В одну з лунок вносять типоспецифічну антисироватку до інфекційного ларинготрахеїту, в другу – контрольну (негативну) сироватку і в третю – досліджуваний антиген.

Чашки Петрі витримують у термостаті за температури 37 ^оС протягом від 24 год до 72 год.

5.4.2.4 Правила опрацювання результатів

Поява в РДП лінії преципітації між антигеном і типоспецифічною антисироваткою свідчить про позитивний результат.

5.4.3 Метод флуоресціюючих антитіл

Суть методу полягає у виявленні вірусного антигену за допомогою специфічної імунофлуоресцентної сироватки. Вірусний антиген виявляють у мазках зі слизової оболонки трахеї або кон’юнктиви птиці у ранній гострій стадії хвороби, в хоріоалантоїсній оболонці та інфікованих культурах клітин.

5.4.3.1 Засоби та допоміжні пристрої

• мікроскоп люмінесцентний з імерсійним об’єктивом типу МЛ-3 згідно з чинними нормативними документами;
• термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 ^оС до 55 ^оС з точністю +0,5^оС;
• холодильник або холодильна камера, що забезпечують температуру від 0 ^оС до 4 ^оС згідно з чинними нормативними документами;
• 5.4.3.2 Методика та правила проведення досліджуванняМазки-відбитки, виготовлені на предметному склі з ураженої хоріоалантоїсної оболонки курячого SPF-ембріону, слизової трахеї або кон’юнктиви хворої птиці, а також культури клітин, яку виростили на склі, підсушують на повітрі, споліскують фізіологічним розчином і витримують в ацетоні у холодильнику за температури 4 ^оС протягом 10 хв. Препарати кладуть на зволожене дно кювети і наносять на кожний препарат по 0,5 см³ робочого розведення флуоресціюючої сироватки.Для фарбування препаратів як контрольну використовують нормальну флуоресціюючу сироватку. Кювету закривають кришкою і витримують 30 хв у термостаті за температури 37 ^оС. Пофарбовані препарати промивають протягом 2 год у проточній воді. Потім препарати підсушують і продивляються під люмінесцентним мікроскопом з імерсійним об’єктивом.

  5.4.3.3 Правила опрацювання результатів

  Результати оцінюють у залежності від ступеню світіння флуоресціюючої сироватки і кількості флуоресціюючих клітин.

  У хворої птиці в період гострого протікання хвороби у мазках спостерігають світіння антитіл.

  5.4.4 Метод імуноферментного аналізу (ІФА)

  Суть методу полягає у виявленні комплексу антиген-антитіло в результаті взаємодії специфічних антитіл з антивидовим пероксидазним кон’югатом, який здатний викликати розпад субстрату з утворюванням кольорового продукту ферментативної реакції.

  5.4.4.1 Засоби та допоміжні пристрої

  Специфічні реагенти:

  • антиген вірусу інфекційного ларинготрахеїту очищений інактивований і адсорбований на поверхні лунок планшетів для ІФА – 2 планшети;
  • позитивна сироватка крові курей до вірусу інфекційного ларинготрахеїту, ліофілізована – 1 амп., 1см³;
  • негативна (нормальна) сироватка крові курей, ліофілізована – 1 амп., 1см³;
  • антивидовий імунопероксидазний кон’югат у стандартному розведенні проти Ig G курей, ліофілізований – 1 амп., 1см³.
  • Неспецифічні реагенти:
  • концентрований розчинник – 1,5М калій-фосфатний буфер, рН 8,2-7,4, рідкий – 1 флакон, 10 см³;
  • детергент твін-20 (тритон Х-305), рідкий – 1 флакон, 5 см³;
  • 5-аміносаліцилова кислота, порошок – 1 флакон, 20 мг згідно з [3];
  • гідроперит, таблетка у стандартній упаковці – 1 шт. згідно з [3];
  • вода дистильована згідно з ГОСТ 6709.

  Устатковання

  • дозувальні піпетки: напівавтоматичні багатоканальні і одноканальні піпетки зі змінними наконечниками об’ємом від 0,05 см3 до 1,0 см3, скляні піпетки на 1,0 см³ і 2,0 см³ згідно з ГОСТ 20292;
  • термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 ^оС до 55 ^оС з точністю +0,5^оС ;
  • холодильник або холодильна камера, що забезпечують температуру від 0 ^оС до 4 ^оС згідно з чинними нормативними документами;
  • рН-метр типу рН-121 або інших модифікацій з діапазоном вимірювання величини рН від мінус 1 до 14 з похибкою вимірювання 0,05 згідно з чинними нормативними документами;
  • промивне устатковання (ручне або автоматичне) для промивання лунок планшета для ІФА;
  • магнітна мішалка ММ 3М або подібного типу, що призначена для перемішування рідин у хімічних лабораторіях згідно з чинними нормативними документами;
  • термометр скляний рідинний згідно з ГОСТ 28498 з діапазоном вимірювання від 0 ^оС до 100 ^оС з границею допустимої похибки вимірювання ±1 ^оС;
• 5.4.4.2 Правила готування до досліджуванняВиготовлення робочих розчинів:Розчин № 1 – 0,01 М калій-фосфатний буфер, утримуючий 0,5М розчину хлориду натрію з 0,1 % кінцевою концентрацією твіна-20, рН від 7,2 до 7,4.

  Для його виготовлення необхідно розчинити вміст флакона з концентрованим розчином, вміст флакона з детергентом твіном-20 і 44,0 г хлориду натрію в 1500 см³ дистильованої води, відфільтрувати, перевірити рН. За необхідності рН коректують 0,1Н гідроокису калію або хлористоводневої кислоти. Розчин призначений для розведення сироваток, антивидового кон’югату і промивання лунок планшета.

  Розчин № 2. Вміст ампули з позитивною сироваткою крові курей розчиняють у 1,0 см³ розчину № 1.

  Розчин № 3. Вміст ампули з негативною сироваткою крові курей розчиняють у 1,0 см³ розчину № 1.

  Розчин № 4. Вміст ампули з антивидовим кон’югатом розчиняють у 20 см³ розчину № 1.

  Розчин № 5. Таблетку гідропериту розчиняють у 15 см³ дистильованої води. До використання розчин зберігають у захищеному від світу місці за температури від 4 ^оС до 8 ^оС.

  Розчин № 6. Вміст флакону з 5-аміносаліциловою кислотою розчиняють у 25 см³ гарячій дистильованій воді за температури (70+2) ^оС при постійному перемішуванні на магнітній мішалці, потім охолоджують до температури від 18 ^оС до 20 ^оС і доводять рН до (6,0+0,1) за допомогою розчину 1 % гідроокису натрію. Розчин готують безпосередньо перед використанням.

  Розчин № 7. Для виготовлення субстратно-індикаторної суміші до 0,1 см3 розчину № 5 добавляють 3,3 см³ холодної (за температури від 4 ^оС до 8 ^оС) дистильованої води, потім до 2 см³ отриманого розчину додають 18 см³ розчину № 6.

  Всі розчини готують безпосередньо перед використанням.

  5.4.4.3 Методика та правила проведення досліджування

  5.4.4.3.1 Для постановки ІФА з набору беруть планшет, упакований в поліетиленовий пакет. Пакет розкривають, знімають кришку з планшету, на поверхні лунок якого вже адсорбовано вірус інфекційного ларинготрахеїту, і використовують для постановки реакції.

  5.4.4.3.2 Розведення сироваток. Зразки дослідних сироваток розводять 1:100 розчином № 1. З цією метою до 9,9 см³ розчину № 1 добавляють 0,1 см³ сироватки крові курей.

  5.4.4.3.3 В 3 лунки (А1, В1, С1) вертикального ряду планшета вносять по 0,1 см³ розведеної 1:100 позитивної сироватки (розчин № 2 – позитивний контроль), а в наступні три лунки (Д1, Е1, F1) вносять по 0,1 см³ розведеної 1:100 негативної сироватки (розчин № 3 – негативний контроль).

  5.4.4.3.4 В інші лунки планшета вносять по 0,1 см³ розведених дослідних сироваток, використовуючи по 2 лунки (2 повтори) на кожну пробу сироватки крові курей. Планшети ставлять в термостат і інкубують за температури (37,5+5) ^оС протягом 60 хв.

  5.4.4.3.5 Після інкубації вміст із лунок планшету видаляють різким струшуванням.

  Планшети промивають розчином № 1 три рази по 5 хв, заповнюючи лунки по 0,2 см³. Видаляють розчин струшуванням або відсмоктують за допомогою спеціального промивного устатковання. Потім планшети підсушують, постукуючи по фільтрованому паперові.

  5.4.4.3.6 В усі лунки планшету вносять по 0,1 см³ розчину № 4 (антивидовий імунопероксидазний кон’югат) і інкубують в термостаті за температури (37,5+5) ^оС протягом 60 хв.

  5.4.4.3.7 Поступають аналогічно 5.4.4.3.5

• скло предметне згідно з ГОСТ 9284;
• кювети металеві згідно з чинними нормативними документами;
• ацетон згідно з ГОСТ 2603;
• фізіологічний розчин, утримуючий 0,85 % хлористого натрію (рН від 7,2 до 7,4);
• масло імерсійне нелюмінесціююче;
• сироватка флуоресціююча.

5.4.4.3.8 Щойно виготовлену субстратно-індикаторну суміш (розчин № 7) вносять в усі лунки планшета по 0,1 см3 і витримують за кімнатної температури протягом часу від 30 хв до 40 хв.

5.4.4.4 Правила опрацювання результатів

Результати реакції визначають візуально.

За наявності специфічних антитіл до вірусу інфекційного ларинготрахеїту вміст лунок з досліджуваними сироватками крові курей має коричневе забарвлення порівняно з кольором забарвлення у лунках з позитивною сироваткою (лунки планшета А1, В1, С1 – позитивний контроль).

Негативними вважають проби сироваток крові курей, які не змінили забарвлення або мають блідо-жовте забарвлення вмісту лунок, аналогічно забарвленню вмісту лунок з негативною сироваткою (лунки планшета Д1, Е1, F1 – негативний контроль).

Позитивний контроль (позитивна сироватка) – вміст лунок ( А1, В1, С1) повинен мати коричневе забарвлення;

Негативний контроль (негативна сироватка) – вміст лунок (Д1, Е1, F1) повинен мати блідо-солом’яне забарвлення або бути безбарвним.

6 Методи лабораторної діагностики інфекційного бронхіту

6.1 Відбирання проб

6.1.1 В лабораторію направляють 4-5 голів свіжих трупів і клінічно хворих курчат віком до 30 діб або курей-несучок .

Для вірусологічного дослідження беруть проби тканин і органів – трахеї, слизової оболонки носової порожнини, нирок і легенів забитої або щойно загиблої птиці, а від дорослої птиці – нирок і яйцепроводів. Під час гострого перебігу хвороби вірус може бути виділений з жовтка яєць.

6.1.2 Для серологічного дослідження беруть проби крові по 5 см3 від кожної птиці. Кров беруть не менше ніж від 10 голів птиці двічі з інтервалом від 14 діб до 21 доби

Кров беруть з підкрильцевої вени, яку протирають етиловим спиртом 70 %. Проби крові набирають в окремі пронумеровані пробірки, попередньо зволожені стерильним фізіологічним розчином. Утворений згусток обводять тонким металевим стержнем або скляною паличкою, потім пробірки вносять у термостат на час від 20 хв до 30 хв за температури 37 оС. Проби крові витримують у холодильнику за температури 4 оС до утворення сироватки. Відстояну сироватку зливають у чисті пронумеровані пробірки.

6.1.3 Патологічний матеріал і сироватки крові пакують, маркують і транспортують згідно з вимогами [2].

6.1.4 Патологічний матеріал і сироватки крові супроводжують документом відповідної форми, який містить дані щодо епізоотології, клініки захворювання і результати розтинання трупів згідно з вимогами [2].

6.1.5 Проби органів і тканин або їх 10 % суспензію на розчині Хенкса або фізіологічному розчині, а також сироватки крові без додавання консервантів зберігають за температури мінус 20 °С.

6.2 Патологоанатомічні зміни

Під час гострого перебігу хвороби на розтині спостерігають гіперемію слизової оболонки носової порожнини та трахеї – накопичення серозно-слизового ексудату з домішкою фібринозних мас. Відзначають осередкову пневмонію, у порожнинах повітроносних мішків – пінистий ексудат. Печінка збільшена, покрита плівкою фібрину. Нирки збільшені, наповнені сечокислими солями, які присутні і у сечопроводах. У дорослих курей виявляють переродження яєчних фолікулів: кісти, перетини, сальпінгіти.

Наявність наведених патологоанатомічних змін дозволяє встановити попередній діагноз на інфекційний бронхіт.

6.3 Вірусологічні методи досліджування

6.3.1 Метод виділення вірусу

Суть методу полягає в ізолюванні та ідентифікації збудника захворювання на курячих ембріонах або на культурі клітин.

6.3.1.1 Засоби та допоміжні пристрої

Для проведення досліджування використовують засоби та допоміжні пристрої згідно з 5.3.1.1 і додатково

• гідролізат лактоальбуміну 0,5 % Хенкса згідно з чинними нормативними документами.

6.3.1.2 Правила готування до досліджування

Проби органів і тканин розтирають у стерильній ступці у фізіологічному розчині у співвідношенні 1:10 і екстрагують протягом 2 год за температури 4 ^оС. Суспензію центрифугують з частотою обертання від 1500 об/хв до 2000 об/хв протягом 15 хв. Надосадову рідину обробляють 2000 ОД/см³ розчином пеніциліну в 2 ОД/см³ стрептоміцину.

6.3.1.3 Методика та правила проведення досліджування

Оброблену антибіотиками надосадову рідину інокулюють в об’ємі 0,2 см³ через повітряну камеру в алантоїсну порожнину шести курячим SPF-ембріонам десятидобового віку.

Заражені ембріони інкубують за температури 37,5 ^оС і відносної вологості від 60 % до 70 %. Овоскопування проводять 2 рази на день. Ембріони, які загинули протягом 24 год після зараження, знищують. Решту ембріонів інкубують протягом 6 діб. Від загиблих протягом цього часу ембріонів відбирають алантоїсну рідину і хоріоалантоїсну оболонку і досліджують на наявність макроскопічних змін через 6 діб.

Проводять 4 послідовних пасажі вірусу на курячих SPF-ембріонах, тому що перший пасаж, у більшості випадків, не спричиняє загибель або змінення ембріонів.

Ідентифікацію вірусу проводять на десятидобових курячих SPF-ембріонах в реакції нейтралізації (РН), використовуючи відомі специфічні антисироватки, як мінімум, до двох основних серотипів вірусів (Massachusetts, Connecticut) з індексом нейтралізації антисироваток більше ніж 3 lg або в реакції нейтралізації у культурі клітин нирок курячих ембріонів чи фібробластів.

6.3.1.4 Правила опрацювання результатів

Вірус вважають ідентифікованим і результат позитивним, якщо ембріони, які інокульовані сумішшю досліджуваного вірусу із специфічною сироваткою, залишаються живими і розвиваються нормально, а ембріони, які інокульовані лише досліджуваним вірусом, гинуть або відстають у розвитку. У ембріонів спостерігають перекручування тіла, “карликовість”, згортання тіла в кулю з характерним закиданням ніг на голову, збільшується кількість амніотичної рідини, оболонки щільно прилягають до ембріону.

У культурі клітин у разі позитивної реакції специфічна антисироватка пригнічує цитопатичний ефект, спричинений вірусом інфекційного бронхіту.

6.4 Серологічні методи

6.4.1 Реакція нейтралізації (РН) на курячих SPF-ембріонах

6.4.1.1 Засоби та допоміжні пристрої

• баня водяна;
• термостат електричний сухоповітряний типу “2ТГ-0-11” чи інших модифікацій, що забезпечують температуру в діапазоні від 28 ^оС до 55 ^оС з точністю +0,5^оС;
• термометр скляний рідинний згідно з ГОСТ 28498 з діапазоном вимірювання від 0 ^оС до 100 ^оС з межею допустимої похибки вимірювання ±1 ^оС;
• пробірки місткістю 10 см³, 15 см³ і 20 см³ згідно з ГОСТ 25336;
• піпетки градуйовані місткістю 1 см³, 2 см³, 5 см³ і 10 см³ згідно з ГОСТ 20292;
• пеніцилін згідно з [3];
• стрептоміцин згідно з [3];
• курячі SPF-ембріони 10-добового віку;
• антисироватки специфічні до інфекційного бронхіту, позитивні;
• штами еталонні вірусів інфекційного бронхіту різних антигенних типів;
• вода дистильована згідно з ГОСТ 6709.

6.4.1.2 Правила готування до досліджування

Проби сироватки крові інактивують прогріванням на водяній бані за температури 56 оС протягом 30 хв. Гемолізовані і забруднені сироватки досліджуванню не підлягають.

6.4.1.3 Методика та правила проведення досліджування

В реакції використовують вірус з титром не нижче ніж 107 ЕІД50/см3. Готують серійні десятикратні розведення вірусу від 10-3 до 10-8. Рівні кількості розведеного вірусу, специфічних антисироваток і досліджуваних сироваток крові змішують і суміш залишають на 1 год за кімнатної температури. Кожним розведенням в об’ємі 0,2 см3 інокулюють по 4 курячих SPF-ембріонів десятидобового віку в алантоїсну порожнину. Інокульовані ембріони інкубують 6 діб з щоденним овоскопуванням.

Ембріони, які загинули протягом перших 24 год, не враховують.

6.4.1.4 Правила опрацювання результатів

Через 6 діб визначають інфекційний титр вірусу і обчислюють ЕІД50. Різниця між логарифмами титру контрольного ряду вірусу і титру суміші вірусу з досліджуваною сироваткою виражає індекс нейтралізації.

У разі отримання значень індексу нейтралізації від 0 до 1,0 результат реакції вважають незадовільним, від 1,1 до 2,0 – сумнівним, від 2,1 і вище – позитивним.

Якщо сумнівний результат отримали у більше ніж 20 % досліджуваних сироваток крові, досліджування проводять в РДП в агаровому гелі. Після отримання сумнівних результатів в РДП проводять досліджування сироваток крові, отриманих після повторного взяття крові від птиці на 14-21 добу. Вірусонейтралізуючі антитіла утворюються через 2-3 тижні після спалаху захворювання і зберігаються до кінця життя, а преципітуючі антитіла – від 2 тижнів до 7 тижнів після початку зараження.

6.4.2 Реакція нейтралізації (РН)на культурах клітин курячих SPF-ембріонів

6.4.2.1 Засоби та допоміжні пристрої

Використовують засоби та допоміжні пристрої згідно з 6.4.1.1 і додатково:

• культури клітин нирок курячих SPF-ембріонів;
• середовища поживні для культури клітин (середовище Ігла, середовище 199) згідно з чинними нормативними документами .

Використовують щойно отриману культуру клітин після утворення суцільного моношару і адаптований до культур клітин вірус з титром від 5 од./см³ до 5,5 од./см³ .

6.4.2.2 Методика та правила проведення досліджування

Готують серійні десятикратні розведення вірусу до 10-6. Кожне розведення вірусу змішують з рівною кількістю специфічної сироватки. Якщо в реакції використовують контрольні сироватки крові кроля, їх розводять до 10-1 і враховують при обчислюванні індексу нейтралізації. Для кожного розведення вірусу і суміші вірусу з сироваткою беруть по 4 пробірки місткістю 20 см3. Розведення вірусу і суміші вірусу з сироваткою вносять в об’ємі 0,1 см3 до кожної пробірки, адсорбують від 30 хв до 40 хв за кімнатної температури, а потім додають підтримуюче середовище в об’ємі 0,9 см3, що містить 2,5 % телячої сироватки, і інкубують у термостаті за температури 37,5°С протягом 6 діб.

6.4.2.3 Правила опрацювання результатів

Облік реакції ведуть за цитопатичною дією вірусу. Різницю логарифмів титру вірусу і суміші вірусу з сироваткою вважають індексом нейтралізації. Результат реакції визначають згідно з 6.4.1.4.

6.4.3 У випадку отримання незадовільного результату в реакції нейтралізації (це може бути пов’язано з неспецифічністю використаної антисироватки до присутнього серотипу вірусу – Massachusetts, Connecticut) проводять реакцію дифузної преципітації (РДП) в агаровому гелі.

6.4.4 Реакція дифузної преципітації в агаровому гелі (РДП)

Реакцію РДП проводять згідно з 5.4.2.

Крім контрольної позитивної і негативної сироваток, в РДП ставлять і контроль на антиген, виготовлений із гомогенату хоріоалантоїсних оболонок незаражених курячих ембріонів того самого віку.

6.4.5 Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА)

6.4.5.1 Засоби та допоміжні пристрої

• водяна баня;
• термометр скляний рідинний згідно з ГОСТ з діапазоном вимірювання від 0 ^оС до 100 ^оС з межею допустимої похибки вимірювання ±1 ^оС;
• центрифуга лабораторна типу “ОС-6М” або інших модифікацій, яка забезпечує частоту обертів не менше ніж 3000 об/хв згідно з чинними нормативними документами;
• мікропіпетки згідно з ГОСТ 29227;

• планшет полімерний для імунологічних реакцій (V-подібний) [4];
• гліцеринізований фізіологічний розчин 0,5 % (рН 7,2);
• сиротка крові кроля;
• сенсибілізовані еритроцити барана;
• еритроцитарний діагностикум для інфекційного бронхіту.

6.4.5.2 Правила готування до досліджування

Отримання нормальної сироватки

Нормальну сироватку отримують з крові кроля, яку відбирають із серця. Сироватка не повинна мати слідів гемолізу. Сироватку кроля прогрівають за температури 56 ^оС протягом 30 хв і виснажують формалінізованими і сенсибілізованими еритроцитами барана (півня). До 10 об’ємів сироватки додають 1 об’єм осаду еритроцитів, ретельно змішують і витримують на водяній бані за температури 37 ^оС протягом 30 хв, потім центрифугують зі швидкістю 3000 об/хв протягом 15 хв, зливають і зберігають 3 місяці.

Готування робочого розведення антигену

Нативний антиген в об’ємі 1,5 см³ розводять у 8,5 см3 0,5 % гліцеринізованого фізіологічного розчину

6.4.5.3 Методика та правила проведення досліджування

Реакцію ставлять у V-подібних полімерних планшетах. Дослідні і контрольні сироватки розводять 0,5 % гліцеринізованим фізіологічним розчином дворазово в об’ємі 0,025 см³, а потім у такому самому об’ємі додають робочий розчин еритроцитарного діагностикуму.

6.4.5.4 Правила опрацювання результатів

За титр гемаглютинації в РНГА приймають останнє розведення сироваток, де спостерігають склеювання еритроцитів при повному або частковому просвітленні надосадової рідини (2 плюси).

За діагностичний титр приймають розведення сироваток крові 1:8.

Проби сироваток крові птиці, які дали сумнівну реакцію гемаглютинації, повинні бути досліджені вдруге через 2 тижні і у разі підтвердження попереднього результату враховуватись як позитивні.

6.4.6 Метод імуноферментного аналізу (ІФА)

6.4.6.1 Засоби та допоміжні пристрої

Використовують засоби та допоміжні пристрої згідно 5.4.4.1 із заміною імуноспецифічних реагентів на такі:

Імуноспецифічні реагенти:

• антиген вірусу бронхіту очищений інактивований і адсорбований на поверхні лунок планшети для ІФА – 2 планшети;
• позитивна сироватка крові курей до вірусу бронхіту, ліофілізована – 1 амп., 1см³;
• негативна (нормальна) сироватка крові курей, ліофілізована – 1 амп., 1см³;
• антивидовий імунопероксидазний кон’югат у стандартному розведенні проти Ig G курей, ліофілізований – 1 амп., 1см3.

Реакцію проводять згідно з 5.4.4 з використанням імуноспецифічних реагентів згідно з 6.4.6.1.

Pages: 1 2 3 4 5 6